Övervakning av tidig tuberkulosbehandling med Xpert bisexual MTB/RIF

till redaktörerna:

framsteg som gjorts för att förbättra laboratoriekapaciteten för tuberkulos (TB) diagnos ledde till utvecklingen av molekylära analyser som nu ersätter konventionell mikroskopi och kulturbaserade metoder i stor skala . Tyvärr upptäcker nuvarande molekylära tekniker både levande och döda bakterier, och ett positivt resultat innebär inte patogenens livskraft. Faktum är att DNA kan kvarstå under en lång period efter bakteriell död och nukleinsyra från döda bakterier är lika amplifierbar. Därför är molekylära analyser olämpliga för behandlingsövervakning och/eller för infektionskontrolländamål.

Vi rapporterar ett innovativt tillvägagångssätt för att selektivt förstärka DNA som härrör från livskraftig Mycobacterium tuberculosis i kliniska prover, vilket är användbart för övervakning av mykobakteriell belastning hos lung-TB-patienter under anti-TB-behandling.

protokollet är baserat på förbehandling av prover med propidiummonoazid (PMA; Biotium Inc., Hayward, CA, USA), en kemisk förening som kan interkalera DNA från icke-livskraftiga (eller membranskadade) organismer men utesluts från livskraftiga bakterier. Efter ljusaktivering binder PMA kovalent till DNA, vilket förhindrar dess amplifiering med PCR . Efter ljusexponering kan obundet PMA inte interagera ytterligare med DNA-molekyler.

analysen optimerades först med hjälp av syrafasta baciller (AFB)-negativa sputumprover spikade med döda eller levande mykobakterier i olika koncentrationer. I korthet tillsattes levande Mycobacterium fortuitum-celler till N-acetyl-cystein dekontaminerade sputumprover negativa för AFB genom smetmikroskopi vid en slutlig koncentration av 106 bakterier·mL−1. En alikvot av detta laboratorietillverkade prov behandlades för att värma döda M. fortuitum-cellerna. PMA-stamlösningen bereddes och lagrades vid -20 c-c och skyddades från ljusexponering, tills användning, som rekommenderas av tillverkarna. PMA tillsattes som en förbehandling vid en slutlig koncentration av 500 oc och inkuberades i 30 min vid 4 oc C i mörkret, följt av ljusexponering för blå ljusemitterande diod (LED)-aktivt ljus (GenIUL, Terrassa, spanien) i 15 min vid rumstemperatur. DNA extraherades sedan med användning av en standard fenolkloroformprocedur. Som en kontroll för att utvärdera effekten av ljusexponeringssteget behandlades en alikvot av naket DNA extraherat från en M. fortuitum-kultur med 500 occurm PMA som tidigare exponerats för LED-ljuset i 15 minuter. Den kommersiella line-probe-analysen (genotyp Bisexuell Mycobacterium CM; Hain Lifescience, Nehren, Tyskland) utfördes sedan för att identifiera kliniskt relevanta mykobakteriella arter . Prover som innehåller levande M. fortuitum visade en normal hybridiseringsprofil på en nitrocellulosremsa, medan prover som behandlades för att döda bakterier inte visade någon förstärkning, förutom den interna kontrollen (data visas inte). Eftersom naket DNA behandlat med ljusinaktiverat PMA visade en normal hybridiseringsprofil var ljusexponeringssteget effektivt och PCR hämmades inte ytterligare av kvarvarande PMA.

Efter att ha optimerat protokollet för inaktivering av DNA som härrör från döda bakterier, anpassade vi det till Xpert bisexual MTB/RIF automatiserad analys (Cepheid, Sunnyvale, CA, USA). Den realtids-PCR som utförs av Xpert Portugals MTB / RIF ger tröskelcykler (Ct) som kan användas för att beräkna skillnaden i amplifieringsutbyte mellan prover med och utan PMA-förbehandling (Bisexuell): en låg Acta indikerar närvaron av amplifierbart DNA från levande bakterier, medan en hög Acta indikerar att mål-DNA i provet härstammar från döda eller skadade bakterier och därför påverkar PMA-förbehandlingen signifikant dess amplifiering. För att beräkna det värde som krävs för att beräkna det värde som vi ansåg medelvärdet mellan Ct-värdena för varje sond som ingår i Xpert 2b MTB/RIF-test (A till E) .

Vi testade PMA-protokollet med hjälp av Xpert bisexual MTB/RIF-analysen på en Ct-kalibreringskurva av AFB-negativa kliniska prover med värmeavdödade/levande mykobakterier tillsatta i olika förhållanden. Höga död-levande förhållanden resulterade i en maximal skillnad i värden för hCG mellan värmebehandlade och levande delar med PMA, medan prover som innehåller en liknande procentandel av dödade och levande bakterier inte kunde differentieras från varandra genom användning av PMA förbehandling (data visas inte). Liknande data har rapporterats av Kralik et al. .

slutligen testade vi tillvägagångssättet på kliniska prover. 10 patienter diagnostiserade med aktiv pulmonell TB (sputum smear positive och culture positive) inkluderades i den första valideringsstudien. Prover samlades in vid tidpunkten för diagnos (t0) och efter 10-20 dagars behandling (t1) dekontaminerades och behandlades N-acetyl-cystein för mgit-960 vätskekultur (BD Diagnostic Systems, Sparks, MD, USA) enligt internationella riktlinjer . Alla patienter var fortfarande AFB-positiva genom sputumutstrykmikroskopi vid t1. Parallellt bearbetades 250 oc-l dekontaminerade prover för molekylär analys med Xpert oc-MTB/RIF-analys med och utan PMA-förbehandling. Proverna bearbetades sedan enligt tillverkarens anvisningar för Xpert Portugals MTB / RIF-analys.

som visas i Figur 1, påverkade PMA inte signifikant PCR-utbytet av prover som samlats in vid t0 (medelvärde av sacr 2,3 sacr 0,5), medan prover som samlats in under behandling vid T1 visade en Sacr på 10,5 sacr 0,9 efter PMA-behandling (p=0,0003) som bekräftar att sputumutstrykningspositiviteten hos dessa prover främst berodde på mycket skadade bakterier. Dessutom visade sig att den beräknade mellan T0 och t1 i PMA-obehandlade prover var för låg (2,9 2,9 0,9) för att uppskatta en reell minskning av bakteriebelastningen på grund av terapin.

två patienter som bedömdes som ” låga ”vid t0 av Xpert ox visade en negativ kultur vid t1, medan alla andra patienter som bedömdes som” medelstora ”eller” höga ” förblev kulturpositiva av MGIT. Även om en exakt tid till positivitet inte kan bedömas, observerade vi att kulturer från prover som samlats in vid t1 blev positiva ungefär 7-10 dagar senare jämfört med kulturer från prover som samlats in vid t0, vilket tyder på en allvarlig minskning av den levande bakteriebelastningen.

alla patienter behandlades och botades framgångsrikt i slutet av behandlingen, och detta överensstämde med minskningen av levande bakterier som detekterades genom PMA-analysen.

som en negativ kontroll inkluderade vi retroaktivt också ett fall av behandlingssvikt (AFB-positivt och kulturpositivt efter 5 månaders standardbehandling). I detta fall påverkade PMA-förbehandling av båda dekontaminerade sputumprover som samlats in vid 1 månad och två under behandlingen inte signifikant PCR-utbytet (AUC-CCT 2), vilket stöder ineffektivitet av anti-TB-behandling.

samma protokoll bör i princip vara kompatibelt med andra CE-godkända molekylära tester och linjeprobanalyser som godkänts av Världshälsoorganisationen för diagnos av TB; ytterligare studier behövs för att utesluta denna möjlighet.

tidigare studier har visat möjligheten att använda PMA för att skilja mellan levande och döda mykobakterier med hjälp av en koncentration av 25-50 kg. Under protokolluppsättningen undviks en slutlig koncentration av 100 oc-m fullständigt amplifiering av DNA härrörande från värmedödad M. fortuitum; en svag bakgrund på grund av amplifieringen av DNA från värmedödad M. tuberculosis observerades (data visas inte). Vi kan spekulera i att den olika cellväggskompositionen på något sätt påverkar PMA: s förmåga att penetrera skadade mykobakterier. Verkligen, Kralik et al. observerade att PMA-inducerad signalreduktion mellan levande och döda Mycobacterium avium subsp. paratuberkulos var lägre jämfört med de som hittades för andra bakteriearter. Dessutom, med tanke på mängden skräp som potentiellt kan sekvestrera PMA-molekyler i dekontaminerad sputum ökade vi den slutliga koncentrationen till 500 oc.m. Ytterligare studier som utvärderar skillnader i PMA-behandlingseffekt på stammar som visar olika cellväggsammansättning (t. ex. Peking-stammar) och/eller i sputa med olika egenskaper (t. ex. blodinnehållande sputum) kan bättre belysa användbarheten av detta test i olika kliniska miljöer.

Enligt l Xhamster Dal et al. , en liten andel celler som antas vara döda eller kraftigt skadade kan inte växa. Närvaron av ett litet antal celler som är kraftigt skadade men icke-odlade kan förklara varför vi fortfarande har en positiv signal i prover som samlats in vid t1 trots PMA-förbehandlingen. PMA-förbehandling undviker inte detektering av en liten andel döda celler (falskt positivt för en viabilitetsanalys): testet kan därför överskatta livskraftiga mykobakterier. Men ur ett kliniskt perspektiv skulle detta representera ett mindre fel jämfört med risken (mycket liten för detta test) att underskatta livskraftiga mykobakterier.

våra data indikerar för första gången att kvantitativa molekylära tekniker i kombination med PMA-metoden kan vara ett alternativ till direkt mikroskopi och kultur för övervakning av tidigt behandlingssvar och för preliminär utvärdering av personliga regimer. Användningen av denna analys kan möjliggöra tidigare utvärdering av behandlingseffektiviteten, vilket visar en tydlig minskning av den vitala mykobakteriella belastningen. Frånvaron av svaret på terapi kan emellertid också snabbt identifieras genom testet som möjliggör en regimförändring och begränsar smittspridningen och ytterligare resistensutveckling .

• 2 ERS 2012