Embryoprojektet Encyclopedia
från 1958 till 1961 utvecklade Leonard Hayflick och Paul Moorhead i Usautvecklat ett sätt i laboratoriet att odla stammar av mänskliga cellermed kompletta uppsättningar av kromosomer. Tidigare kunde forskare intehåll cellkulturer med celler som hade två kompletta uppsättningar avkromosomer som normala mänskliga celler (diploid). Som ett resultat, forskarekämpade för att studera mänsklig cellbiologi eftersom det inte fanns en tillförlitligkälla till celler som representerade diploida mänskliga celler. I theirexperiments, Hayflick och Moorhead skapade varaktiga stammar av humancells som behöll både kompletta uppsättningar av kromosomer. De frös sedan prover från kulturerna så att cellerna förblev livskraftiga för futureresearch. De noterade också att celler bara kunde dela upp en vissantal gånger innan de försämrades och dog, ett fenomen som senare kallades Hayflickgränsen. Hayflick och Moorheads experiment möjliggjorde forskning om utvecklingsbiologi och vacciner som förlitade sig på humancell-stammar.
Hayflick specialiserat sig på odling av celler i kontrollerade miljöer. 1958 gick han med i Wistar Institute i Philadelphia, Pennsylvania, en forskningsinstitution som studerade cellbiologi ochvirus, på inbjudan av institutets nya direktör HilaryKoprowski. Koprowski gav Hayflick i uppdrag att skapa cellkulturer förAnvänd i experiment från andra forskare vid Institutet. Hayflicklater erinrade dock om att han använde sitt forskningsuppdrag som en möjlighet att studera metoder och begränsningar för cellkulturer. Tillassist i odling av celler rekryterade Hayflick sin Wistar-kollega, Paul Moorhead, som studerade strukturen och funktionen hos celler ochkromosomer.
bristen på livslängd hos normala humana cellkulturer ilaboratoriet begränsade forskning som forskare kunde göra. Med cellkulturer växer forskare populationer av celler i glasvaror okontrollerade förhållanden för användning i forskning. Forskare odlar vanligtvis cellkulturer i glasvaror eller petriskålar som innehåller tillväxtmedium,en lösning som innehåller upplösta salter, sockerarter och andra cellnäringsämnen. Under första hälften av det tjugonde århundradet antog forskare att alla normala,friska cellkulturer hade aninnatförmåga att dela sig på obestämd tid baserat på tidigare upptäckterpublicerad av biologen Alexis Carrel 1912 i USA. I praktiken observerade forskare dock inte oändlig uppdelning i normala celler.Istället försämrades cellerna i kulturen så småningom och dog. Forskare ansåg att celler försämrades för att de hade tömt odlingsmediet för alla dess näringsämnen eller för att laboratorie tekniker hade misslyckats med att upprätthålla idealiska miljöförhållanden förcellulär tillväxt. De enda mänskliga cellerna som ständigt delades inlaboratorieinställningar, kallade odödliga cellinjer, var celler härledda från cancerceller. Dessa cellinjer representerade endast några aspekterav mänsklig cellbiologi.
i mitten av det tjugonde århundradet, medicinskforskare kunde inte förklara vad som orsakade cancer, och många forskare,inklusive Hayflick och Moorhead, antog att vissa virussom kan orsaka cancerväxter. Även om många mikrobiologer användeceller härledda från cancercellinjer i medicinsk forskning, cellernaanvändes vanligtvis inte i utvecklingen av vacciner eftersomforskare oroade sig för att vaccinerna skulle vara förorenade medcancer-orsakande virus som eventuellt finns i cellerna själva. Vidare var celler från cancerlinjer på grund av deras konstantdivision heteroploid, vilket innebär att de antingen hade större eller färre antal kromosomer än normala mänskliga celler, som har tvåkompletta uppsättningar kromosomer. Heteroploidceller berodde ofta påden kontinuerliga celldelningen över många generationer av celler ikultur.
Hayflick och Moorehead producerade mänskliga celler som kunde odlas under många generationer, som celler från cancercelllinjer, men också bevarade cellernas diploida antal kromosomer och minskade risken från teoretiska cancerframkallande virus. Debeskrev sitt experiment i ”seriell odling av mänskliga Diploidcellstammar”, publicerad 1961.
Hayflick och Moorhead försökte utveckla stammar av mänskliga celler som kunde odlas under lång tid i laboratoriet men behöll fortfarande sitt diploida antal kromosomer. De antog att om de vartransplanterade små prover av diploida mänskliga celler från redan växande kulturer till en ny tillväxtmiljö, skulle de kraftigt öka antalet diploida celler i kulturen. Hayflick och Moorhead föreslog att frysning av små mängder diploida celler skulle pausa cellulärtillväxt och delning utan att döda cellerna. Frysta celler kunde sedan lagras tills forskare krävde dem, vid vilken tidpunkt de kunde de frysta cellerna och återställa dem till normal cellulär aktivitet.Hayflick och Moorhead förutspådde att efter upptining skulle de odlade cellerna inte bli heteroploida som celler från andra linjer och skulle behålla sin diploida uppsättning kromosomer.
Hayflick och Moorhead ’ experiment syftar till att både skapa en metod för odling av mänskliga diploidceller i laboratoriet för långsiktig forskning användning, och att bestämma huruvida eller inte dessa cellstammar bidragit till cancer utväxter.Hayflick och Moorhead först växte mänskliga celler i laboratorie growthcultures, transplanterade små prover av celler i nya behållare togrow ytterligare cellkulturer, och frös prover av celler från thosecultures att bevara cellerna för senare forskning. Därefter, för att testa om de frusna cellerna fortfarande var livskraftiga för forskning, Hayflick och Moorheadthawed de frusna cellerna och försökte växa cellkulturer från dem.Slutligen implanterade de prover av de mänskliga diploida cellstammarna ilevande vävnader för att se om de ledde till cancerväxter.
För att utveckladiploida humana cellstammar började Hayflick och Moorhead odla celler från 25 olika vävnader som hämtats från aborterade foster. Dessa celler blev 25 olika mänskliga cellstammar, namngivna numeriskt WI-1genom WI-25. WI stod för Wistar Institute, där cellstrains utvecklades. Hayflick och Moorhead används fostervävnadereftersom mer än vuxna celler, fosterceller lättare utvecklasin i fibroblastceller, som är specialiserade celler som gerstrukturellt stöd till de flesta kroppsvävnader. Fibroblastceller var föredragna för laboratoriecellodling eftersom de växte snabbt och kontinuerligt i cellkulturer, vilket gav ett överflöd av celler förforskning. Hayflick och Moorhead skär varje vävnadsprov ismå, tunna skivor och implanterade dem sedan på innerväggen av glasflaskor fyllda med näringsrikt tillväxtmedium. Hayflick och Moorheadplacerade sedan de vävnadsbelagda flaskorna i varje cellstam i en varm miljö i tre dagar och ersatte regelbundet tillväxtmediet med en ny tillförsel för att börja odla cellkulturen.
Hayflick andMoorhead låt kulturerna växa tills cellerna täckte hela glasflaskan. Varje prov av fosterceller delades sedan upp genom en processkallad subkultur. Under subkultivation avlägsnade Hayflick och Moorhead ett litet prov av celler och implanterade dessa celler på väggen i en ny glasflaska fylld med tillväxtmedium, vilket skapade en nycellkultur av samma cellstam. Varje ny cellkulturkonstituerade en ny generation av celler som i sig kunde vidareodlas med samma metod, vilket möjliggjorde det totala antalet celler att växa exponentiellt. Hayflick och Moorhead delade sedan prover av de återstående cellerna i små portioner och frös dem för att pausa cellernas tillväxt och stoppa ytterligare celldelning.
Hayflick och Moorheadfortsatte subkultiverande celler två gånger i veckan i ungefär tio månader, vid vilken punkt cellkulturerna slutade växa och började försämras.Hayflick och Moorhead antog att cellerna hade slutat dela sigPå grund av en uppbyggnad av giftiga produkter av cellulär tillväxt itillväxtmedium. Hayflick och Moorhead försökte introducera färsk tillväxtmedium som var fri från eventuella toxiner, men cellkulturernafortsatte att försämras och dö under de kommande månaderna. Men andra cellkulturer placerade i samma tillväxtmedium nedbrytes inteoch dö. Forskarna drog slutsatsen att något om cellernasjälva, inte deras miljö, fick dem att börja försämras.
Hayflick och Moorhead försökte därefter bestämma huruvida de celler som de hade fryst fortfarande kunde användas för att odla fler cellkulturer. Efter upptining av små prover av celler, Hayflick och Moorheadimplanterade cellerna på väggarna i glasflaskor. De odlade dem igen i Tillväxtmedier och upptäckte att även efterfrysning växte cellerna fortfarande i nya kulturer, vilket själv kunde subkultiveras. Oavsett tidigare frysning eller subkultivationer kan forskare använda prover från diploida humana cellkulturer för att växamer diploida humana cellkulturer. Hayflick och Moorhead hade skapat adiploid mänsklig cellstam som kunde odlas i laboratoriekulturer tidigt på obestämd tid.
Hayflick och Moorhead undersökte sedan huruvida cellerna som odlades i de nya kulturerna var diploida. När de skrev om experimentet sa de att de var oroliga för attcellerna kanske inte har förblivit diploida eftersom de hade odlat dem över många generationer, vilket kan leda till heteroploidi. Med hjälp av ljusmikroskop tittade Hayflick och Moorhead på prover av celler under celldelningens metafas, när kromosomer är distinkta ochlätt sett. De räknade antalet kromosomer i 250individuella celler för att få en uppskattning av hur många celler som fortfarande hade adiploid antal kromosomer. Hayflick och Moorhead bestämde detmer än 97 procent av cellerna var diploida även efter mer än tjugogenerationer av subkultur. Hayflick och Moorhead drog slutsatsen attderas process av seriell odling och frysning av fosterceller var en effektiv metod för att bevara en diploid mänsklig cellstam.
slutligen behövde Hayflick och Moorhead visa att deras cellstammar inte orsakade cancer. Problemet med de odödliga cellinjerna skapade fråncancerceller var att forskare antog att cellerna kaninnehålla cancerframkallande virus. För att säkerställa att deras newcell-stammar inte orsakade cancer, testade Hayflick och Moorhead cellstammen Wi-25 i levande vävnad. De valde Wi-25-sträckaneftersom den hade genomgått de flesta underavdelningarna och var den mest sannolika cellstammen för att orsaka cancer. Därför, om det inte gjorde det, var det troligtatt ingen av de andra stammarna skulle heller.
forskarna implanteradeceller från WI-25-cellstammen i kindpåsarna på fem livinghamsters. Som en experimentell kontrollgrupp implanterade de också femandra hamsters kindpåsar med celler härledda från cancercelllinjer. Först uppträdde noduler, ett tidigt tecken på att utveckla canceri kontrollpåsarna av båda uppsättningarna hamstrar. Men efter tre veckor hade nästan alla knölar i hamstrarna implanterade med WI-25cells försvunnit medan knölarna i hamstrarna implanterade med celler från cancerceller linjer hade alla ökat i storlek. Hayflickand Moorhead utförde biopsier av de återstående nodulerna för att bekräftaderas förutsägelse att deras subkultiverade celler inte orsakade cancer.Biopsierna visade att nodulerna i hamstrar implanterade med celler från cancercellinjer verkligen var cancerösa, medan WI-25-cellnodulerna berodde på inflammation och blödning vid implantationsplatsen.
Hayflick och Moorhead implanterade också en liknande human cellstrain, WI-1, i muskelvävnaderna hos fem döende cancerpatienter.Han implanterade också celler från cancercellinjer i fem andraterminala cancerpatienter. Liksom i hamstrarna växte först knutarvid implantationsställena för båda grupperna. Efter ett par dagar, Wi-1-cellknutor började recede, medan nodulerna multiplicerade inpatienter implanterade med celler från cancercellinjer. I slutet aven vecka hade nästan alla WI-1-nodulerna försvunnit, och Hayflick andMoorhead biopsierade de återstående nodulerna i båda grupperna. Resultaten avbiopsierna visade att cancercellknutorna var heteroploidceller, medan WI-1-nodulerna var diploida och icke-cancerösa. Hayflickand Moorheads fynd, som de publicerade 1961,demonstreradeatt mänskliga diploida celler kunde förökas över många generationer, som cancercellinjer, utan att bli heteroploida eller cancerösa.
resultaten hade en omedelbar och varaktig inverkan påförståelsen av utvecklingsbiologi och vetenskaplig forskning. Resultaten av deras experiment bekräftade Carrels hypotes från 1912 att normala celler växte på obestämd tid i kultur, trots observationer av cellkulturer som försämrades över tiden. Carrel hade föreslagit attPå grund av att celler i praktiken tycktes försämras och ålder Övertid berodde på ofullkomliga laboratorietillväxtförhållanden för cellerna.Carrel hävdade att under ideala förhållanden kunde celler i kulturerdela på obestämd tid och effektivt fungera som en odödlig cellinje.Hayflick och Moorheads fynd indikerade emellertid att åldrande oorganismer händer på cellulär nivå,en process som kallas senescens, och att celler endast kunde genomgå ett begränsat antal divisioner innan de försämrades och dog. Under deras experiment, Hayflick och Moorheadförsökte ständigt odla fosterceller och ersätta gammal tillväxtmedium med färskt, näringsrikt medium. Men de fann detefter ungefär fyrtio eller sextio generationer började cellerna dö snarareän reproducera, ett fenomen som senare kallades Hayflickgränsen. Resultatet visade att cellerna inte kunde växa på obestämd tid ikultur, även under idealiska förhållanden.
Hayflick och Moorheads metod för seriell odling av humana diploida celler hjälpte också forskare att bibehålla ett rikligt utbud av diploida mänskliga celler för forskning. Genomhayflick och Moorheads beräkningar kunde en enda mänsklig cellstam subkultiveras tillräckligt många gånger för att producera nästan 20 ton avviabla celler. Även om det inte är tekniskt odödligt, skulle det utbudet varanära outtömlig för praktiska forskningsändamål.
dessutom möjliggjorde skapandet av livskraftiga diploida humana celler vaccinforskning.Eftersom Hayflick och Moorhead visade att deras mänskliga cellstammar inte orsakade cancer hos hamstrar eller människor, kunde dessa stammar användas invacciner utan hot om att förorena vaccinet med något cancerframkallande medel. Efterföljande liknande härledda humana cellstammar, såsom WI-38, blev grunden för vacciner för barnsjukdomarsom rubella och vattkoppor.
medan många forskare välkomnade utvecklingen av mänskliga cellstammar av Hayflick och Moorhead, vissa,inklusive den katolska kyrkan, ogillade användningen av avbrutet fetalmaterial vid utveckling av vacciner av religiösa skäl. Vatikan uppgav senare att de motsatte sig utvecklingsmetoden för vacciner som härrör från fostervävnader, inte för individens användning av dessa vacciner för att förebygga sjukdomar.
Hayflick och Moorhead visade inte bara att mänskliga celler framgångsrikt kunde odlas i laboratoriet samtidigt som de fortfarande behöll ett diploid antal kromosomer, men också att de kunde behålla cellerna nästan obestämdgenom seriell subkultur. Dessutom lade deras experiment grunden för Hayflick för att ytterligare undersöka gränsen för celldelning i kultur, senare kallad Hayflick-gränsen. Hayflick och Moorheads upptäckter möjliggjorde ytterligare experiment inom utvecklingsbiologi och vaccinutveckling genom att tillhandahålla rikliga mänskliga celler för forskning.