fördelar och begränsningar av mikroarrayteknik i human cancer

i April i år bevittnade vi en av de mest monumentala prestationerna inom biologi: den fullständiga sekvenseringen av det mänskliga genomet. Avkodningen och databasavsättningen av miljarder sekvensbaser är utgångspunkten för postsequence funktionell genomik. Upptäckten av det periodiska systemet hade en viktig inverkan på kemi. Så också, den fullständiga dechiffreringen av det mänskliga genomet kommer att ha imponerande effekter på människors hälsa och livskvalitet. För närvarande förstår vi funktionen av endast ett begränsat antal mänskliga gener. Att studera alla mänskliga gener fungerar är en teknisk utmaning. För att möta denna utmaning har nya verktyg med hög kapacitet utvecklats. Mikroarrayanalysen är en kraftfull molekylär teknik som möjliggör samtidig studie av uttrycket av tusentals gener eller deras RNA-produkter, vilket ger en exakt bild av genuttryck i cellen eller provet vid tidpunkten för studien.

till exempel kan uttrycket av alla gener för läkemedelsresistens och metabolism eller alla kända onkogener i en cell detekteras och mätas inom samma tidsram (Brown och Botstein, 1999; Collins, 1999; Lander, 1999). Mikroarrayen kan definieras som en ordnad samling av mikrospots (sonderna), varje fläck som innehåller en enda art av en nukleinsyra och representerar generna av intresse. Denna teknik är baserad på hybridisering mellan märkta fria mål härledda från ett biologiskt prov och en uppsättning av många DNA-prober som är immobiliserade på en matris (Southern et al., 1999). Målen produceras genom omvänd transkription och samtidig märkning av RNA-extrakt från ett biologiskt prov hybridiserat med DNA-fragmentprober. Hybridiseringssignalen som produceras på varje sond är mRNA-uttrycksnivån för motsvarande gen i provet vid tidpunkten för studien. Signalerna detekteras, kvantifieras, integreras och normaliseras med dedikerad programvara och återspeglar ’genuttrycksprofilen’ eller ’molekylärt porträtt’ för varje biologiskt prov.

många tusentals eller tiotusentals distinkta fläckar kan skrivas ut på en kisel-eller glasskiva eller en nylon solid state-bas. Det finns huvudsakligen två varianter av mikroarrays: cDNA och oligonukleotidmikroarrays (Schena et al., 1995, 1996; Lockhart et al., 1996). Även om båda typerna av mikroarray används för att analysera genuttrycksmönster, är dessa varianter fundamentalt olika (Lipshutz et al., 1999). I cDNA-mikroarrayer immobiliseras relativt långa DNA-molekyler på en fast yta. Denna typ av microarray används mest för storskalig screening och expressionsstudier. Oligonukleotidmikroarrayen tillverkas genom in situ ljusriktad kemisk syntes eller genom konventionell syntes följt av immobilisering på en glasmatris. Denna mikroarray används för detektion av mutationer, genkartläggning och expressionsstudier och möjliggör differentialdetektering av genfamiljmedlemmar eller alternativa transkript som inte kan särskiljas av cDNA-mikroarrayer.

mikroarrayens kemi i sig är inte ny, eftersom hybridiseringstekniken har varit väl etablerad i årtionden. Den samtidiga studien av tusentals gener omvandlar emellertid mikroarraytekniken till ett kraftfullt helsystemanalysverktyg. Nästan 10 år har gått sedan de första mikroarraysna skapades, och ändå förbättras och utvecklas denna teknik fortfarande. Sedan den första introduktionen har antalet mikroarrayapplikationer expanderat (Figur 1). Med utgångspunkt från deras användning vid genscreening och målidentifiering hittar denna teknik nya applikationer som utvecklingsbiologi, sjukdomsklassificering, vägstudier, läkemedelsupptäckt och toxikologi. Tekniken som är involverad i produktion och användning av mikroarrayen ligger utanför ramen för denna översyn, men har granskats omfattande någon annanstans (Schena et al., 1995; Niemeyer och Blohm, 1999; Bowtell, 1999; Brown och Botstein, 1999; Celis et al., 2000; Cheung et al., 1999; Duggan et al., 1999; Graves, 1999; Khan et al., 1999; Hegde et al., 2000; Meldrum, 2000). Vi beskriver här några av de senaste utvecklingen och resultaten inom mikroarrayteknik inom cancerforskning, diskuterar potentiella problem, beskriver kliniska tillämpningar och kommenterar framtiden för denna teknik.

antal citat som finns i MEDLINE genom att infoga ”microarray” (grå stapel) eller ”microarray+cancer” (vit stapel) för en PubMed sök. Artiklar publicerades mellan 1995 och 2002

vikten av att mäta globalt genuttryck i humana cancerformer

som karakteriserar populationen av transkriberade gener har lett till skapandet av en ny term, transkriptomet (Su et al., 2002). Detta koncept definierar den kompletta uppsättningen transkriberade gener uttryckta som messenger RNA för en viss art. Transkriptomet representerar därför universum av RNA-budbärare som kan koda för proteiner. Endast cirka 5% av generna är aktiva i en viss cell vid varje given tidpunkt. De flesta av generna undertrycks, och denna kontroll kan förekomma på antingen transkriptionell eller translationell nivå. Eftersom regleringen av proteinuttryck på transkriptionsnivå är effektivare sker mest kontroll på denna nivå. Genuttrycksprofilen för en cell bestämmer dess funktion, fenotyp och svar på yttre stimuli. Därför kan genuttrycksprofiler hjälpa till att belysa cellulära funktioner, biokemiska vägar och regleringsmekanismer. Dessutom kan genuttrycksprofiler av sjukdomsceller / vävnader, jämfört med normala kontroller, främja förståelsen av sjukdomspatologi och identifiera nya terapeutiska interventionspunkter, förbättra diagnosen och klargöra prognosen.

under de senaste åren har flera genuttrycksprofileringsmetoder dykt upp och har tillämpats framgångsrikt på CancerForskning. Dessa inkluderar differentialvisning, seriell analys av genuttryck och mikroarrayer (Velculescu et al., 1995; Granjeaud et al., 1999; Cheng et al., 2002). Mikroarrayerna har blivit viktiga eftersom de är lättare att använda, Kräver inte storskalig DNA-sekvensering och tillåter parallell kvantifiering av tusentals gener från flera prover. Genuttrycksprofilering av cancer representerar den största kategorin av forskning med hjälp av mikroarrayteknik och verkar vara den mest omfattande metoden för att karakterisera cancer molekylärt. Även om cancerfenotypen endast delvis bestäms av dess transkriptom, ger den fortfarande en tydlig bild av en Cells fysiologiska tillstånd. Kraften i detta tillvägagångssätt har visats i studier utförda på ett stort antal maligniteter, inklusive cancer i bröst, huvud och nacke, lever, lunga, äggstockar, bukspottkörtel, prostata och mage (Bhattacharjee et al., 2001; Dhanasekaran et al., 2001; Garber et al., 2001; Tonin et al., 2001; Al Moustafa et al., 2002; Belbin et al., 2002; Chen et al., 2002; Han et al., 2002; Hedenfalk et al., 2002; Hippo et al., 2002; Luo et al., 2002a).

flera studier av cancerprofilering genom mikroarrayanalys har använt olika strategier såsom tumör kontra kontroll, där tumörgenuttrycksprofilen jämförs med dess motsvarande kontrollprov för att mäta skillnaderna och likheterna mellan båda fenotyperna, cancerstratifiering, där genuttrycksprofilerna från olika prover av samma cancertyp jämförs för att avslöja distinkta undergrupper för att bättre definiera molekylär klassificering av en vanlig histologisk typ av cancer och slutligen tidsmässig utvärdering av tumören, där genuttrycksprofilen jämförs med expressionsmönster från tumörprover härledda från olika stadier av progression jämförs för att belysa skillnaderna mellan de tidiga och avancerade stadierna av sjukdomen. Även om många studier av mikroarrayanalys i mänsklig sjukdom har publicerats, presenterar vi här några av dem som har ett kliniskt intresse för onkologi.

mikroarray och prostatacancer

flera studier som använder mikroarrayer för att karakterisera prostatacancergenuttrycksprofiler har nyligen publicerats. Dessa studier har använt microarray-teknik som ett genupptäcktsverktyg för att identifiera genetiska markörer som diskriminerar mellan normala och cancerösa prostatavävnader. En enkel mikroarraystudie har utförts med hjälp av fläckiga membranmatriser för att analysera normala och cancervävnader och cellinjer (Bull et al., 2001). Membranmikroarrayfynd begränsas av den relativa okänsligheten hos denna teknik för att detektera transkript uttryckta vid låga nivåer och det lilla antalet fläckar som kan placeras på membranen; denna studie har dock gett kandidatmarkörer för prostatacancer för vidare utvärdering. Fem publicerade studier har analyserat genuttrycksprofiler i flera tusen gener i normala och prostatavävnader och använt oövervakad hierarkisk klusteranalys för att sortera prover (Dhanasekaran et al., 2001; Luo et al., 2001, 2002b; Welsh et al., 2001A; Singh et al., 2002). Dhanasekaran et al. (2001) kunde skilja normal prostata, godartad prostatahyperplasi (BPH), lokaliserad prostatacancer och metastatiska prostatacancerprover med hjälp av 9,984 element-spotted microarrays. Med hjälp av hierarkisk klusteranalys, Luo et al. (2001) kunde diskriminera 16 prostatacancerprover från nio BPH-prover på grundval av skillnader i genuttrycksprofiler mätt på 6500 elementfläckade cDNA-mikroarrayer. Welsh et al. (2001A) rapporterade en liknande sortering av normala och maligna prostatavävnadsprover med användning av oligonukleotidmikroarrayer. Intressant nog identifierade alla fem grupperna transmembranserinproteas hepsin som visar signifikant ökat uttryck i maligna vävnader jämfört med normal prostatavävnad (Dhanasekaran et al., 2001; Luo et al., 2001, 2002b; Welsh et al., 2001A; Singh et al., 2002). Många andra kandidatmarkörer för prostatacancer såsom proto-onkogen PIM1 har framkommit från andra studier och undersöks vidare som potentiella diagnostiska markörer. Det minskade PIM1-uttrycket på immunhistokemi av prostatatumörprover gav en ökad risk för återfall efter operationen (Dhanasekaran et al., 2001). Andra grupper som använder kombinationer av subtraktiv hybridisering och mikroarrayanalys har identifierat flera potentiella kandidater för immunmodulerande terapi för prostatacancer inklusive prostein (Xu et al., 2001), STEAP (Hubert et al., 1999) och p504S/Alfa-Metylacyl-CoA-Racemas (Jiang et al., 2001). I en mycket ny studie, Virolle et al. (2003) använde en prostatacancercellinje som uttrycker en hög konstitutiv nivå av Egr1-protein, en transkriptionsfaktor som överuttrycks i majoriteten av aggressiva tumörgeniska prostatacancerceller. De bedömde Egr1-transkriptionsreglering genom att utföra en oligonukleotidmikroarrayanalys med hjälp av celler som gjordes bristfälliga i Egr1 som jämförelseprov för identifiering av Egr1-målgener. För första gången i prostatavävnader bekräftade denna studie tillväxtförstärkarrollen för Egr1 som tidigare observerats i andra cellulära system och identifierade flera nya målgener som specifikt kontrollerar tillväxt, cellcykelprogression och apoptotiska vägar.

mikroarray och oral cancer

hittills har endast ett fåtal mikroarraystudier som är relevanta för oral cancer publicerats. Chang et al. (1998) illustrerade användningen av cDNA-mikroarrayer för att karakterisera transformationsrelaterade gener i oral cancer. Villaret et al. använde en kombination av komplementär DNA-subtraktion och mikroarrayanalys för att utvärdera unika gener som är specifika för skivepitelcancer i huvud och nacke (HNSCC) som potentiella tumörmarkörer och vaccinkandidater. Nio kända gener befanns vara signifikant överuttryckta i HNSCC jämfört med normal vävnad. Dessutom överuttrycktes fyra nya gener i en delmängd av tumörer (Villaret et al., 2000). Alevizos et al. (2001) analyserade transkriptomet i plavocellkarcinom i munhålan. De hittade cirka 600 kandidatgener (onkogener, tumörundertryckare, transkriptionsfaktorer, differentieringsmarkörer, metastatiska proteiner och xenobiotiska enzymer) som differentiellt uttrycktes i oral cancer och validerade endast tre av dessa gener med PCR.

Lu et al. (2001) använde microarray-metoden för att utvärdera genuttrycksprofilförändringar under initiering och progression av skivepitelcancer i matstrupen. De undersökte genuttrycksprofiler i olika stadier av initiering och progression av matstrupscancer för att identifiera gener som differentiellt uttrycks mellan dessa steg. Frierson et al. (2002) använde oligonukleotidmikroarrayanalys för att studera uttrycket av 8 920 olika humana gener i 15 adenoidcystiska karcinom (ACCs), en ACC-cellinje och fem normala stora spottkörtlar. Bland gener med förändrat uttryck i ACC var de som kodar för transkriptionsfaktorerna SOX4 och AP-2 gamma, kaseinkinas 1 såväl som epsilon och frizzled-7, vilka båda är medlemmar i Wnt/beta-catenin-signalvägen. I en mycket ny studie, Leethanakul et al. (2003) genererade cDNA-bibliotek med hög komplexitet från laserfångande mikrodissekerade normala och cancerösa skivepitel. I denna studie undersökte författarna den tillgängliga sekvensinformationen med hjälp av bioinformatiska verktyg och identifierade 168 nya gener differentiellt uttryckta i normalt och malignt epitel. Dessutom, med hjälp av cDNA-arrayer, fick de bevis för att en delmängd av dessa nya gener kan uttryckas starkt i HNSCC.

mikroarray och bröstcancer

Med tanke på den kliniska heterogeniteten hos bröstcancer kan mikroarrayteknik vara ett idealiskt instrument för att skapa en mer exakt klassificering. Initiala studier med mikroarraybaserad expressionsprofilering visade sin förmåga att korrekt klassificera östrogenreceptornegativa och östrogenreceptorpositiva bröstcancer (Perou et al., 2000; West et al., 2001) och för att skilja BRCA1-relaterade tumörer från BRCA2-relaterade och sporadiska tumörer (Hedenfalk et al., 2001; van ’ t Veer et al., 2002).

studien av van ’ t Veer et al. har varit en av de mest omfattande och informativa studier som hittills utförts. Författarna undersökte 117 primära bröstprover genom mikroarraybaserad genuttrycksprofilering för att utveckla prognostiska profiler och jämföra dessa med kända prognostiska markörer i bröstcancer. Av de 5 000 generna med variabla uttrycksprofiler identifierades 70 för optimal noggrannhet vid förutsägelse av återkommande sjukdom. Med hjälp av denna klassificering förutspådde författarna korrekt det faktiska resultatet av sjukdomen för 65 av de 78 patienterna. Fem patienter med god prognos och åtta patienter med dålig prognos tilldelades felaktigt. Standardprognostiska markörer vid bröstcancer användes för att uppskatta risken för återfall av cancer och hjälpa till att fatta beslut om adjuvant terapi. Tyvärr identifierar nuvarande prognostiska markörer inte tillräckligt med den mest korrekta behandlingen för patienten. Den prediktiva kraften i microarray-metoden är mycket större än för närvarande använda metoder, men den måste valideras i mer prospektiva kliniska studier. Om det prognostiska värdet av detta tillvägagångssätt bekräftades skulle uttrycksprofileringsklassificeraren resultera i ungefär en fyrfaldig minskning av patienter som får adjuvant terapi i onödan (Caldas och Aparicio, 2002).

Martin et al. (2001) beskrev en metod för att identifiera cirkulerande bröstcancer genom en tvåstegsprocess av differentialdisplay och högkänslig array-baserad uttrycksprofilering. Även om potentialen för denna teknik är lovande, måste dess känslighet och specificitet fortfarande förbättras och mer arbete krävs för att bestämma den kliniska betydelsen av genuttrycksprofildetektering i perifert blod. Vissa artiklar har nu visat en koppling mellan tumöruttrycksprofiler med hjälp av mikroarrayteknik och kliniskt resultat. Till exempel Sorlie et al. (2001) visade att tumörunderklasser definierade genom uttrycksprofilering kan förutsäga sjukdomsfri och total överlevnad, och Sotiriou et al. (2002) visade att förbehandlingsuttrycksprofiler förutspådde kliniskt svar på kemoterapi i ett litet urval av brösttumörer. Även om studien av Sorlie et al. var mycket provocerande, författarna jämförde inte det prognostiska värdet av de grupper som identifierades genom hierarkisk kluster med för närvarande använda prognostiska faktorer vid bröstcancer. Eftersom läkemedelsresistens i cancer är ett stort hinder för framgångsrik kemoterapi är möjligheten att erhålla en potentiell molekylprofil eller fingeravtryck av cancer mot cancer i cancerceller med mikroarrayteknik avgörande för att förutsäga kemoterapirespons. Kudoh et al. (2000) visade denna förmåga att definiera förändringar i genuttrycksprofiler i en bröstcancercellinje behandlad med kemoterapi. De övervakade expressionsprofilerna för MCF-7 bröstcancerceller som antingen behandlades tillfälligt med doxorubicin eller valdes för resistens mot doxorubicin. Denna studie visade att övergående behandling med doxorubicin förändrade uttrycket av en mångfaldig grupp gener på ett tidsberoende sätt.

mikroarray och äggstockscancer

under de senaste åren har flera utredare publicerat intressanta studier om uttrycksprofilering av äggstockscancer. Martoglio et al. (2000) analyserade genuttrycksprofilerna för fem normala äggstockar och fyra dåligt differentierade serösa papillära äggstocksadenokarcinomprover. Med hjälp av en liten ’in-house’ nylon membran cDNA microarray, fann de en total ökning av angiogenes-relaterade markörer (t.ex. angiopoietin-1, VEGF), apoptotiska och neoplastiska markörer, immunsvar mediatorer och nya potentiella markörer för äggstockscancer (t. ex. cofilin, moesin och neuronbegränsande ljuddämpare faktor protein) i cancervävnaden. Studien var spännande eftersom de använde en billig cDNA-array skräddarsydd för studier av specifika vägar, såsom angiogenes och tumörgenes. Eftersom det är problematiskt att få tillgång till en tillräcklig mängd tidig äggstockstumörvävnad, använde forskarna olika strategier för att kringgå behovet av vävnadsmängder som vanligtvis krävs av mikroarrayanalys. Till exempel, Ismail et al. (2000) rapporterade en studie av 864 DNA-element som screenades mot 10 äggstockscancerceller och fem normala epitelcellinjer med kortvarig cellodling för att expandera äggstocksytepitelet före RNA-extraktion. Andra utredare renade äggstocksepitel genom in vitro-förfaranden, såsom vidhäftning till glas eller immunomagnetisk anrikning (Ono et al., 2000; Welsh et al., 2001b). Dessa två tillvägagångssätt kan emellertid införa fördomar i observerat genuttryck. Faktum är att det första tillvägagångssättet (Ismail et al., 2000) använder odlade cancerceller, som kanske inte återspeglar in vivo-cancer på grund av möjligheten att sekundära genuttrycksförändringar uppträder in vitro som ett resultat av odlingsförhållanden. Den andra strategin (Ono et al., 2000; Welsh et al., 2001b) är mycket lång och kan resultera i nedbrytning av mindre stabila RNA-budbärare. För att undvika eventuella fördomar som är inneboende i in vitro-kulturer som används i vissa studier (Ismail et al., 2000; Matei et al., 2002) har andra utredare studerat genuttrycksmönster direkt från kirurgiskt resekterade tumörer (Shridhar et al., 2001). Små, specialiserade mikroarrayer har flera praktiska fördelar och kan avslöja information som kan gå förlorad i större mikroarrayer. Sawiris et al. (2002) använde en högspecialiserad cDNA-mikroarray som heter ’Ovachip’ och fann denna mikroarray extremt känslig vid differentiering av äggstockscancer från koloncancer baserat på genuttrycksmönster. Screening biomarkörer för äggstockscancer är mycket viktiga på grund av det sena stadiet vid diagnos och dålig överlevnad i samband med denna typ av cancer. Nyligen använde två studier mikroarrayteknik för att identifiera två överuttryckta potentiella ovariecancerserummarkörer som kallas osteopontin och prostasin och rapporterade preliminär validering av deras användning för tidig upptäckt av sjukdomen (Mok et al., 2001; Kim et al., 2002).

Microarray och andra cancerformer

tillämpningen av microarray-teknik på andra humana cancerformer expanderar snabbt. Den banbrytande studien av Golub et al. (1999) visade möjligheten att skilja akut myeloid leukemi och akut lymfoblastisk leukemi (ALL) baserat på genuttrycksövervakning och hur de två klasserna i en simulerad situation ’blindad’ för den histologiska diagnosen kunde ha upptäckts av genuttrycksmönstren ensamma. Alizadeh et al. (2000) identifierade de två formerna av diffust stort B-celllymfom (DLBCL) på grundval av genuttrycksprofiler som indikerar olika stadier av B-celldifferentiering. Intressant nog har denna molekylära klassificering prognostiskt värde oberoende av stratifiering med den vanliga kliniska graderingen. För att studera genuttryck i lymfoida maligniteter skapade en stor samarbetsgrupp en specialiserad mikroarray med namnet ’Lymphochip’, som berikas i gener som selektivt uttrycks i lymfocyter och i gener som reglerar lymfocytfunktion (Alizadeh et al., 1999). Denna grupp använde denna mikroarray för att undersöka DLBCL och fann två molekylärt olika former av denna tumör. Vidare visade de att DLBCL-undergrupperna definierade en undergrupp av patienter med en distinkt klinisk prognos. För att testa hypotesen att B-cell kronisk lymfocytisk leukemi (CLL) är mer än en sjukdom, Rosenwald et al. (2001) relaterade genuttrycksmönstren för CLL till deras ig-mutationsstatus och till andra typer av normala och maligna B-celler. Intressant nog uttrycktes generna som starkt uttryckta i CLL jämfört med DLBCL ekvivalent i alla CLL-prover oavsett deras ig-mutationsstatus. Denna studie föreslog att alla CLL-fall delade en gemensam mekanism för transformation och / eller ursprungscell. En ny studie (Stratowa et al., 2001) har föreslagit en lista över potentiella nya prognostiska markörer som är involverade i lymfocythandel och associerade med sjukdomsstagning och/eller patientöverlevnad.

i en mycket ny studie, Gariboldi et al. (2003) analyserade genuttrycksprofilerna i den normala vävnaden hos hudtumörkänsliga och resistenta möss för att identifiera gener som spelar en funktionell roll i genetisk mottaglighet. Denna studie har föreslagit en roll av Scca2-genen, en medlem av serinproteashämmaren superfamilj, i den genetiska predispositionen till hudtumörer.

Microarray-teknik har också använts vid analys av melanom (Bittner et al., 2000). Denna studie föreslog att genuttrycksprofiler inom en enskild patients vävnad kan anmärkningsvärt bevaras över tid och att global transkriptanalys kan identifiera okända subtyper av kutant melanom och förutsäga experimentellt verifierbara fenotypiska egenskaper.

studier på koloncancerceller och vävnader visade signifikant undertryckande av kinasgenen, WEE1Hu (Backert et al., 1999).

många transkriptomer förändras efter specifikt överuttryck av tumörrelaterade gener. Till exempel har vi använt ett adenovirusmedierat uttryckssystem av RB2/p130 tumörsuppressorgen i en icke-liten lungcancercellinje för att identifiera specifika gener som regleras av pRb2/p130 (Russo et al., 2003). Våra microarray-resultat har identifierat en mängd olika gener som är involverade i många cellulära processer inklusive celldelning, cellsignalering/cellkommunikation, cellstruktur/motilitet och genuttryck och metabolism. Dessa resultat tyder på nya potentiella terapeutiska biomarkörer i lungkarcinom. Vidare indikerar resultaten från en annan cDNA-mikroarraystudie att överuttrycket av tumörsuppressorgenen PTEN kan hämma lungcancerinvasion genom att nedreglera en panel av gener (Hong et al., 2000). Mot bakgrund av ovanstående data är det uppenbart att mikroarraymetoden är mycket viktig vid analysen av en mängd olika tumörtyper.