litiumklorid dödar effektivt honungsbisparasiten Varroa destructor genom ett systemiskt verkningssätt
pilotstudie: från RNAi till litiumklorid
i en pilotstudie burades mite-infekterade honungsbin och matades sackarossirap innehållande dsRNA av potentiellt väsentliga varroagener (kompletterande tabell S1). Vanlig sackarossirap (obehandlad) och sirap med dsRNA baserat på kodningssekvensen för det gröna fluorescerande proteinet GFP (dsGFP ctrl) fungerade som kontroller. GFP uttrycks i den bioluminescerande hydrozoan maneten Aequorea victoria. GFP-sekvensen valdes som en kontroll eftersom ingen homolog gen finns i genomet av honungsbin eller Varroa-kvalster. I den obehandlade gruppen var mitedödligheten <5%. Däremot dödades alla kvalster på bin som fick sackaroslösning innehållande dsRNA riktade mot Varroa-gener effektivt inom tre dagar. En identisk effekt på kvalster observerades emellertid i ett kontrollexperiment där bin matades GFP dsRNA (kompletterande Fig. S1). Dessa resultat utesluter den föreslagna RNAi-medierade mekanismen men föreslog antingen en ännu okänd effekt av RNA eller aktiviteten hos andra komponenter i testlösningen. Eftersom höga koncentrationer av litiumklorid (LiCl) användes vid framställning av dsRNA och därför matades till bina tillsammans med dsRNA, valde vi att mata LiCl i sackaroslösning till burbin för att testa dess aktivitet mot varroamider. Påfallande dödade LiCl i koncentrationer av 25 mM, vilket motsvarar den beräknade koncentrationen i dsRNA-lösningen, kvalsterna lika effektivt som testämnena som innehåller dsRNA. Dessutom, efter att LiCl till stor del avlägsnades från dsRNA genom omfattande tvättning (tvättad dsGFP ctrl), minskade den miticida aktiviteten avsevärt, vilket indikeras av försenad start och minskad aktivitet (kompletterande Fig. S1). Från dessa data drog vi slutsatsen att LiCl, inte RNA knockdown, medierade den observerade aktiviteten på Varroa kvalster och att det skulle vara värt att analysera LiCl: s potential som varroacid.
effektiv koncentration av litiumklorid
för att bekräfta de primära observationerna i vår pilotstudie etablerade vi burförsök med olika koncentrationer av LiCl för robust statistisk analys. Förutom 25 mm-koncentrationen, som visade sig vara effektiv i pilotstudien, använde vi koncentrationer på 2 mM, 4 mM och 10 mM för att bestämma den lägre effektivitetsgränsen. Resultaten stödde resultaten från den tidigare studien och visade signifikanta miticidala effekter för LiCl-koncentrationer så låga som 2 mM vid vilken en väsentlig ökning av kvalsterdödligheten (P < 0,001, log-rank test; kompletterande tabell S2) visades. Högre koncentrationer på 10 mM och 25 mM båda signifikant förbättrad kvalsterdödlighet från och med dag två av behandlingen och uppnådde utrotning av mer än 96% av de behandlade kvalsterna i slutet av experimentet (Fig. 1a, kompletterande tabell S2). I kontrollexperimenten utan LiCl i utfodringslösningen nådde kvalsterdödligheten i genomsnitt 9,3% och låg därför väl inom det dödlighetsområde som erhölls för kvalster som hölls på obehandlade burbin under olika miljöförhållanden33. Baserat på dessa resultat bekräftade vi en tydlig effekt av LiCl på mite viabilitet i ett koncentrationsområde mellan 2 mm och 25 mm.
dödlighet av foretisk Varroa kvalster och honungsbin efter utfodring litiumklorid (LiCl) till Bur bin. (a) Kaplan-Meier överlevnadskurva för kvinnliga Varroa kvalster hålls på bur bin matas med LiCl i koncentrationer mellan 2 mM–25 mM (n = 33, 9, 9, 12, och 9 burar för 0 mM (kontroll), 2 mm, 4 mM, 10 mM och 25 mM, respektive). Vid alla koncentrationer var överlevnaden av kvalster i behandlingsgrupperna signifikant annorlunda än kontrollen (P < 0, 001, log-rank test med Bonferroni-korrigering). (b) Kaplan-Meier överlevnadskurva för burarbetare bin och kvinnliga Varroa kvalster efter 24 h LiCl exponering (n = 9 burar). Överlevnaden av kvalster i behandlingsgruppen skilde sig signifikant från kontrollgruppen (P < 0,001, log-rank test) men det fanns inga signifikanta gruppskillnader i bidödlighet.
i dessa experiment matades de burbina med respektive koncentration av LiCl under flera dagar tills alla kvalster dödades av behandlingen. För potentiell användning i biodlingspraxis skulle emellertid en kortare och definierad behandlingsperiod vara att föredra. Vi utförde därför ett ytterligare experiment, där den mest effektiva koncentrationen av 25 mM LiCl (Fig. 1a) administrerades i 24 timmar följt av utfodring med sockerlösning under ytterligare sex dagar. I slutet av observationsperioden, 92.9% av kvalsterna (n = 225 kvalster, P < 0,001, log-rank test) dödades utan någon signifikant effekt på de behandlade bin (se nästa stycke). Detta resultat visar tydligt att även en kortvarig utfodring av 25 mM LiCl är tillräcklig för att avsevärt minska kvalsterpopulationen.
för att exakt bestämma den intagade mängden LiCl av bin som är nödvändig för att döda parasiterande kvalster, matades 12 nykläckta bin artificiellt 10 kg LiCl-lösningar på 4 mm till 100 mM och hölls individuellt med en phoretic mite i fem dagar i burar. Med 4 mM-och 10 mM-lösningarna, som motsvarade ett upptag på 1,7 respektive 4,2 kg LiCl, var effekten inte signifikant annorlunda än den obehandlade kontrollen (n = 12 kvalster, P = 1.000, log-rank test, kompletterande tabell S3). En enstaka dos på 25 mM, motsvarande 10,6 Baccarat LiCl som konsumeras av biet, var emellertid tillräcklig för att döda 100% av de phoretiska kvalsterna inom 48 timmar (Fig. 2).
dödlighet av phoretic Varroa kvalster hålls på bin som var individuellt matade 10 occyl av en litiumkloridlösning i koncentrationer från 4 mM till 100 bina matades LiCl endast en gång i början av experimentet, sedan fick de sackarossirap under fem dagar. För varje koncentration analyserades 12 burar med ett bi och en varroakvalster vardera. Överlevnaden av kvalster reducerades signifikant jämfört med kontrollgruppen när koncentrationer på 25 mM och högre matades till bin (P < 0,001, log-rank test).
effekt på arbetarbin
för analys av toleransen för LiCl för arbetarbin, testburar som användes för att analysera kvalsterdödlighet (Fig. 1a) registrerades dessutom för dödligheten hos arbetarbina. Efter exponering för 2 mM, 10 mM och 25 mM LiCl som har visat sig utöva miticid aktivitet, varierade den behandlade arbetarbidödligheten i genomsnitt från 3 till 7% inom de olika utfodringsgrupperna. Med undantag för 10 mM LiCl-gruppen (n = 12 burar, P = 0,015, log-rank test; kompletterande tabell S4) skilde sig värdena inte signifikant från 4% mortalitet i den obehandlade kontrollgruppen. Dessutom var dödligheten i våra kontroller väl inom intervallet för dödligheten hos icke-behandlade burbin som krävs som kontroll i toxikologiska test34, vilket bekräftar giltigheten av vårt testsystem. Även 24 h-behandlingen med LiCl påverkade inte dödligheten hos arbetarbin (Fig. 1B; n = 9 burar, P = 0,308, log-rank test). En god tolerans för LiCl till bin bekräftades också genom utfodring av en enstaka dos (för kvalddödlighet se Fig. 2) som inte framkallade en signifikant ökning av arbetarbidödligheten (P = 1.000, log-rank test; kompletterande tabell S5).
därefter matades olika koncentrationer av LiCl kontinuerligt tills det sista burbiet dog för att undersöka svaret på långvarig exponering. Här minskade behandlingen avsevärt den genomsnittliga livslängden för nykläckta arbetarbin från 26 dagar i de obehandlade kontrollburarna till 23 respektive 22 dagar för 2 mM respektive 10 mM LiCl (n = 60 bin, P = 0,024, log-rank test; kompletterande tabell S6). Hos bin som fick den högsta koncentrationen på 25 mM LiCl minskade livslängden signifikant till 19 dagar i genomsnitt (Fig. 3a).
dödlighet av honungsbin efter utfodring av litiumklorid till burbin. (a) Kaplan-Meier överlevnadskurva för burarbetare bin under kronisk LiCl-exponering. LiCl-dieter i koncentrationer av 2 mM, 10 mM och 25 mM matades Ad libitum till den sista biens död (n = 6 burar med 10 bin vardera). Överlevnaden för alla behandlade grupper skilde sig signifikant från sockersirapskontrollen (P < 0, 01, log-rank test med Bonferroni-korrigering). (B) Kaplan-Meier överlevnadskurva för burarbetare bin efter en 24 h LiCl exponering. LiCl-dieter i koncentrationer av 2 mM, 10 mM och 25 mM matades ad libitum under de första 24 timmarna efter kläckning och ersattes sedan med sackarossirap (n = 12 burar med 10 bin vardera). Överlevnaden för alla behandlade grupper skilde sig inte signifikant från sockersirapskontrollen (P > 0,1, log-rank test med Bonferroni-korrigering).
LiCl verkar dock hindra biets livskraft endast om det administreras under en längre tidsperiod, vilket indikeras av ett ytterligare experiment där LiCl matades under de första 24 timmarna efter kläckning och sedan ersattes med sackarossirap tills det sista burbiet dog (Fig. 3b). Här varierade den genomsnittliga livslängden för nykläckta arbetarbin från 22 dagar (10 mM) till 24 dagar (kontroll) utan signifikanta skillnader mellan behandlingarna (n = 120 bin per behandling, p 0.126, log-rank-test, kompletterande tabell S7). Baserat på dessa data från burbin, drar vi slutsatsen att även en kortvarig LiCl-behandling är tillräcklig för att helt utrota Varroa-mite-angrepp med liten eller ingen inverkan på arbetstagarnas bina. Dessa resultat som erhållits i burtester under kontrollerade förhållanden representerar ett framgångsrikt och lovande första steg mot ett nytt tillvägagångssätt för Varroa-behandling. Effektivitet och biverkningar måste dock bekräftas under fältförhållanden.
fälttester med litiumklorid i konstgjorda svärmar
för att ungefärliga fältförhållanden testade vi 25 mm och 50 mM LiCl i nio broodfria konstgjorda svärmar bestående av en drottning och cirka 20 000 bin vardera. Dessa koncentrationer valdes baserat på tidigare experiment med burbin med den högsta dosen som fortfarande tolererades av bin i korta appliceringstider (25 mM). Eftersom en jämn fördelning av sackarossirap genom hela den konstgjorda svärmen på cirka 20 000 bin kan ha varit svår att uppnå, testade vi dessutom en 50 mM koncentration av LiCl för att säkerställa att varje bi utsattes för tillräckliga mängder litium. Följaktligen matades svärmarna ad libitum med sackarossirap innehållande 25 mM LiCl (n = 6) eller 50 mM (n = 3) under en period av tre dagar, följt av en topisk applicering av Perizin XXL. Perizin, som innehåller organofosfatkumaphos som aktiv ingrediens, är en mycket effektiv varroacid som vanligen används som kontrollbehandling35. Mitedödligheten övervakades under en period av fem dagar. Före kontrollbehandlingen dödade 25 mM LiCl cirka 90% av de kvalster som finns i de konstgjorda svärmarna (Tabell 1). Den högre koncentrerade lösningen (50 mM) ökade emellertid inte denna effekt (2-testet, p = 0,953). Sammantaget var effekten något lägre jämfört med burtesterna. En förklaring kan vara att fördelningen av LiCl inom ett kluster av tusentals bin kräver mer tid tills det sista enskilda biet förbrukar en tillräcklig dos för att döda respektive parasiterande kvalster. Den nödvändiga utfodringstiden för sådana enorma enheter på 20 000 bin och mer måste analyseras i ytterligare experiment.
effekt av andra litiumföreningar och icke-litiumsalter
för att bekräfta litium som den aktiva komponenten för effekten på Varroa-kvalster testade vi en serie litiumföreningar och jämförde de miticida effekterna med icke-litiumsalter. Av särskilt intresse var litiumcitrat, en förening med tre litiumjoner, litiumsulfat och litiumkarbonat, som har två litiumjoner jämfört med endast en litiumjon i LiCl. Ytterligare föreningar med en litiumjon (litiumlaktat, litiumacetat), men olika löslighet, kemisk reaktivitet och pris inkluderades för att analysera effekt och tolerans jämfört med LiCl. I burförsök eliminerade alla föreningar 100% av kvalsterna vid 25 mM inom tre (litiumcitrat och litiumacetat) till fyra dagar (litiumsulfat, litiumlaktat och litiumkarbonat). Dessutom dödade 4 mM-testlösningarna helt phoretiska kvalster inom fem (litiumcitrat, litiumsulfat och litiumacetat) till sju dagar (litiumlaktat) förutom litiumkarbonat (Tabell 2; kompletterande tabell S8).
Arbetarbidödligheten ökade inte signifikant vid någon koncentration jämfört med de obehandlade kontrollbina, förutom 25 mM litiumsulfat och 25 mM litiumlaktat (kompletterande tabell S9). Med dessa experiment kunde vi bekräfta att andra litiumföreningar har en liknande potential för användning som en systemisk akaricid. Detta kan öka flexibiliteten för en eventuell design av en veterinärprodukt. Med tanke på priset är litiumklorid och litiumcitrat de billigaste föreningarna. Litiumsulfat är mindre lämpligt på grund av den lägre bietoleransen och litiumkarbonat på grund av en relativt låg vattenlöslighet.
för att undersöka den koncentrationsberoende effekten av litiumföreningar mer detaljerat jämförde vi LiCl med litiumcitrat (Li3C6H5O7), som hade den största skillnaden i antalet litiumjoner per molekyl, vid fem olika koncentrationer i ett intervall av 1 mM–25 mm. Alla koncentrationer av litiumcitrat uppvisade signifikant högre akaricid aktivitet jämfört med LiCl, men det fanns ingen skillnad i binas dödlighet (tabell 3, Tilläggstabeller S9 och S11). Därför kan litiumcitrat representera en ännu bättre aktiv ingrediens.
som en litiumfri kontroll och för att utesluta klorid som ett aktivt medel testade vi också de alkaliska salterna natriumklorid (NaCl) och kaliumklorid (KCl) och även magnesiumklorid (MgCl) vid 25 mm. vi observerade inte en varroacidal effekt för NaCl eller KCl (n = 3 burar, P = 1.000, log-rank test, kompletterande tabell S12). I tester med MgCl dog 100% av bina i bur inom fem dagar (P < 0.001, log-rank test), och enligt det minskande antalet bin avslutades experimentet innan effekten på kvalster kunde analyseras. Baserat på dessa experiment drog vi slutsatsen att litium verkligen förmedlar akaricid aktivitet på ett dosberoende sätt och att litiumcitrat uppvisar de mest gynnsamma egenskaperna hos alla hittills testade föreningar.
potential för litiumföreningar som ny varroacid
Vi har visat att inte de initialt hypoteserade dubbelsträngade rna: erna mot väsentliga Varroa-gener utan överraskande litiumsalter förmedlar en stark akaricid effekt på Varroa-kvalster på burbin och i artificiella svärmar. Således visar dessa resultat att litiumföreningar representerar en ny klass av akaricidala medel med en enastående potential och anmärkningsvärt god tolerans av bin. Den olika känsligheten hos kvalster och bin för LiCl är ännu mer anmärkningsvärd med tanke på att på grund av utspädningseffekter kommer koncentrationen av LiCl i binens hemolymf troligen att vara väsentligt lägre än den koncentration som matas till bin.
viktigt är att våra resultat inte innebär att akaricida effekter av RNAi-baserade tillvägagångssätt som publicerats av Garbian et al.32 förmedlas vanligtvis av LiCl. Efter utfodring av en blandning av dsRNA till honungsbin under en period av 60 dagar, Garbian et al.32 registrerade en långsam ökning av kvalsterdödligheten med en slutlig behandlingseffekt på endast 60%. Med tanke på det snabba och mycket effektiva svaret från våra artificiella svärmar på behandlingar med LiCl är olika verkningssätt troliga: medan RNAi-medierade effekter verkar utöva långsiktiga effekter representerar litiumföreningar en oberoende mekanism med snabb start och hög effekt.
som varroacid visar LiCl vissa funktioner som är unika i denna kombination: (i) LiCl verkar systemiskt via honungsbifoder (”lätt att applicera”), (ii) Det är vattenlösligt och kommer därför inte att ackumuleras i bivax,vilket är ett avgörande problem för långsiktiga behandlingskoncept med syntetiska varroacider med lipofila egenskaper36, 37 (iii) den orala toxiciteten hos de flesta litiumföreningar för däggdjur är relativt låg38 (iv) det har ingen repellent effekt på utfodringslösningen inom det relevanta koncentrationsområdet 2-25 mM39 och (v) Det är tillgängligt till måttliga priser. Mycket lovande är det faktum att en enda applicering av endast 10 oc LiCl i en 25 mM lösning (motsvarande en dos av 10,6 oc LiCl) per enskild bi är tillräcklig för att döda phoretiska kvalster. En utmaning för vidare forskning kommer att vara utvecklingen av en smart applikationsteknik för fullstora svärmar och kolonier för att säkerställa att alla bin får den kritiska mängden aktiv förening.
För närvarande vet vi inte hur LiCl dödar phoretic Varroa kvalster, och det finns få publikationer om effekten av LiCl i insekts40. I humanmedicin har litium använts sedan 1870-talet och är ett humörstabiliserande medel som är indicerat för behandling av maniska episoder och som underhållsbehandling för bipolär sjukdom41. Med tanke på deras terapeutiska användning har litiumföreningar och deras toxicitetsprofil undersökts noggrant. Hittills har ett antal enzymer som verkar på metabolism, utveckling, hematopoiesis och andra processer föreslagits som potentiella mål42,43. Dessa enzymer kräver metalljoner och litium utövar sin aktivitet på ett okompetitivt sätt, vilket sannolikt uppstår genom att förskjuta en divalent katjon. Visserligen har vi för närvarande ingen indikation på att den observerade miticida effekten av litiumföreningar är beroende av ett jämförbart verkningssätt.
Vi är också medvetna om att våra resultat endast utgör det första steget mot utvecklingen av en ny veterinärprodukt. Fälttester i fritt flygande kolonier är lika nödvändiga som analys av subletala och långsiktiga biverkningar på vuxna bin och honungsbi och eventuella restproblem i honung.
resultaten som presenteras här indikerar dock redan att LiCl har potential som en effektiv och lättanvänd behandling för konstgjorda och naturliga svärmar och särskilt för det stora antalet paketbin som används för pollinering i Usa11,44. Vidare kan belysandet av åtgärdsmekanismen öppna nya vägar för målinriktad utveckling av veterinärprodukter för att bekämpa varroamider.