MRSA-detektion
meticillinresistenta Staphylococcus aureus (MRSA) detektions-och identifieringsmetoder
nyckelpunkter
- Gram +ve coccus
- druvliknande kluster av celler
- Resitant mot meticillin och andra penicilliner
- kan också kallas ORSA
meticillinresistent Staphylococcus aureus (MRSA) rapporterades först i början av 1960-talet och betraktas nu som en stor sjukhusförvärvad patogen över hela världen. Termen meticillinresistent används historiskt för att beskriva resistens mot någon av denna klass av antimikrobiella medel. Idag i USA ca. 35% av sjukhusstammarna av S. aureus är resistenta mot meticillin (eller andra penicillinantibiotika), och de senaste åren har uppkomsten av vankomycinresistent S. aureus (VRSA) orsakat ytterligare oro.
resistens uppstår när organismen har en mecA-gen som producerar ett förändrat penicillinbindande protein, PBP2a (även känt som PBP2′) och antingen en oxacillinmik på 2 mg/l eller en meticillinmik på 4 mg/l.
infekterade och koloniserade patienter är reservoaren för MRSA både på sjukhus och samhället med överföring i allmänhet via kontakt med vårdpersonal.
effektiv, snabb laboratoriediagnos och känslighetstestning är avgörande vid behandling, hantering och förebyggande av MRSA-infektioner.
detektionstekniker
Laboratoriescreening för MRSA är en komplex balans mellan resultathastighet, känslighet, specificitet och kostnad.
för närvarande utförs majoriteten av screening med hjälp av plattbaserade metoder. Undersökningar tyder på att denna metodgrupp står för >90% av de utförda screeningtesterna.
men ett antal alternativa metoder inklusive buljongbaserade metoder, kromogena medier, snabba screeningpaket, molekylära analyser och automatiserade system används alltmer. Isolering från screening kompresser kan vara en långdragen procedur, på grund av antalet ’förorenande’ organismer som finns i kompresser från icke-sterila platser.
buljongbaserade anrikningsmedier används vanligtvis för att öka känsligheten. Detta är dock på bekostnad av resultatets hastighet. NaCl tillsätts i allmänhet till basbuljongen tillsammans med antingen meticillin, oxacillin, cefoxitin. Indikatorföreningar kan också användas för att ge en tidig indikation på närvaron av MRSA.
Solid Agar Media: Det finns inga universella standardiserade metoder för screening och isolering av MRSA med solid agar media. Många selektiva medier är tillgängliga, och dessa är beroende av hämmare som NaCl och/eller antibiotika för att underlätta valet, tillsammans med en pH-indikator för att markera presumtiva. Exempel är Mannitolsaltagar innehållande 7% NaCl med antingen 4 mg/L meticillin eller 2 mg/l oxacillin; Oxacillin resistent Screening Agar med 5,5% NaCl och 2 mg/l oxacillin; Baird Parker Medium med 8 mg/l ciprofloxacin; Mueller Hinton Agar med 4% NaCl och 6 mg/l oxacillin. Känslighet vid 24hrs inkubation är variabel med 48hrs inkubation krävs ofta för ett acceptabelt resultat.
nyligen utvecklade kromogena medier kombinerar primär tillväxt och selektivitet med differentiering från koagulasnegativa stafylokocker. Dessa medier visar förbättrad specificitet jämfört med traditionella medier. Känsligheten förbättras också men kräver 48 timmars inkubation för att uppnå >85%.
majoriteten av molekylära metoder som används för detektering av MRSA är in-house, förlitar sig på multiplexerade PCR-primrar som detekterar gener som är specifika för S. aureus (NUC,fem) och mecA som detekterar meticillinresistens. De flesta är endast lämpliga för användning med rena kulturer och inte screening av svabbar på grund av närvaron av koagulasnegativa stafylokocker som bär den meticillinresistenta genen mecA. Nyare kommersiellt tillgängliga förstärkningsanalyser som riktar sig mot mecA i kombination med andra specifika markörer såsom koagulas och har visat uppmuntrande resultat
det har skett ett antal utvecklingar med bioluminescens i synnerhet användningen av adenylatkinas (AK), ett enzym som finns i alla celler som producerar ATP från ADP. Ak-mätning är känsligare än ATP-baserade system och möjliggör rutinmässig detektering av 50 organismer eller mer i ett prov. Tidiga prestandadata visar resultat som motsvarar konventionella plattodlingsmetoder samtidigt som de ger resultat inom 5 timmar.
identifiering / bekräftelse
traditionellt bekräftelse av S. aureus utförs med användning av glidkoagulasprovet (klumpfaktor) och rörkoagulasprovet (fritt koagulas). Positiva effekter på glidkoagulasprovet bör bekräftas med rörkoagulasprovet. DNase media plattor kan också användas men positiva kräver ytterligare bekräftelse.Agglutinationssatser är allmänt tillgängliga och kan användas för att bekräfta S. aureus genom att detektera protein A och klumpfaktor, även om vissa stammar av MRSA har låga nivåer av dessa proteiner. Nyare Kit fungerar nu genom att också detektera ytantigen. Andra latexsatser detekterar PBP2a som förekommer i cellmembranet och kräver lys av cellerna för detektering.
ett brett utbud av kommersiella biokemiska kit finns tillgängliga, både manuellt och automatiserat. Dessa är baserade på en rad biokemiska tester som ger en profil bedömd mot databaser/tabeller. Många automatiserade system kombinerar biokemisk identifiering av S. aureus med antibiotikakänslighetspaneler för bekräftelse av MRSA.
Antibiotikakänslighetsmetoder
metoder för meticillin-och oxacillinkänslighetstestning är omfattande och publicerade data är motstridiga med avseende på rekommendationer.
det finns ingen enda metod som är lämplig för alla MRSA-stammar. Standardmetoder publiceras av British Society for Antimicrobial Chemotherapy (BSAC) och i USA, av Clinical Laboratory Standards Institute (CLSI), tidigare känt som NCCLS.
minsta hämmande koncentration med utspädningsmetoden har traditionellt varit referensmetoden.
BSAC rekommenderar användning av Mueller Hinton eller Columbia-agar med 2% NaCl och 104 cfu/ml inokulat inkuberat vid 30 kg C. CLSI rekommenderar Mueller Hinton-Agar med 2% NaCl och 104 cfu/ml inokulat inkuberat vid 33-35 kg C.
molekylära metoder som detekterar mecA-genen ersätter MIC som referensmetod.
Antibiotikakänslighetstestning med skivdiffusionsmetoder är fortfarande den mest använda men resultaten påverkas av en rad faktorer inklusive medium, NaCl-koncentration, temperatur, inokulum och testmedel.
ett antal nya studier med cefoxitinskivdiffusionsmetod tyder på större tillförlitlighet än med oxacillin. Ingen speciell medium eller inkubationstemperatur krävs och testet påverkas mindre av hyperproducenter av penicillinas.
det senaste CLSI-tillägget (M100-S14) föreslår användning av 30 occurg cefoxitinskivor med hjälp av en brytpunkt på <= 19mm som indikation på resistens hos S. aureus mot oxacillin. Andra mediabaserade metoder inkluderar agar, buljongbaserade brytpunktsmetoder (2 mg/l oxacillin, 4 mg/l meticillin) och agar-screeningsmetoder som rekommenderas av CLSI (godkänd standard M7-A6).
MRSA är inte längre bara en infektion som förvärvas på sjukhus, även om detta fortfarande är en primär överföringskälla.
alltmer MRSA kan förvärvas i samhället och faktiskt från husdjur . Detta är kanske den mer oroande trenden på grund av den potentiellt stora värdpopulationen och betonar behovet av betydligt ökade kontroller av hur och när antibiotika används.
utbredd leverans av antibiotika utanför kliniskt signifikanta användningar kan endast leda till ytterligare urval av organismer som är resistenta mot högre nivåer av antibiotika.
definitioner: vad är ESKAPE-patogener?
kallas ofta i media som ’superbugs’, ESKAPE-patogenerna (Enterococcus faecium, Staphylococcus aureus, Klebsiella pneumoniae, Acinetobacter baumannii, Pseudomonas aeruginosa, Enterobacter spp.) anses vara den främsta orsaken till sjukhusförvärvade infektioner globalt.
få de senaste uppdateringarna i snabba mikrobiologiska testmetoder skickas till din e-post? Prenumerera på det kostnadsfria nyhetsbrevet rapidmicrobiology