PMC

Dubbelsträngbrott i DNA kan orsaka kaos i celler om de inte repareras. Därför föreslogs att ändarna av kromosomer kan vara specialiserade cap-strukturer som inte erkänns som dubbelsträngsbrott, vilket förhindrar cellcykelstopp, nedbrytning och rekombinationsfusion (Muller, 1938; McClintock, 1939). Vi vet nu att telomerer består av ändarna av kromosomer och är väsentliga för genomstabilitet. Telomerer består av tandem head-to-tail upprepningar av en kort g-rik sekvens; till exempel är mänskliga telomerer 2-20 kb av (TTAGGG)n upprepningar. Kromosomändarna är inte trubbiga och 3′-änden (G-rik sträng) överhäng i en enda sträng som kan invadera det inre av telomeren för att förskjuta den inre G-rika sekvensen och bilda en T-loopstruktur (Griffith et al., 1999; Cesare et al., 2003; Doksani et al., 2013), vilket skyddar kromosomändarna från att erkännas av cellen som dubbelsträngsbrott, förutom skydd av proteiner som binder telomeren.

eukaryota kromosomer dupliceras via semikonservativ replikation med en ledande (kontinuerlig syntes för nettotillväxt vid 3′ – änden av den framväxande ledande strängen) och eftersläpande (diskontinuerlig Okazaki-fragmentsyntes för nettotillväxt vid 5′ – änden av den framväxande eftersläpande strängen) långsträckt sträng som visas i Fig. 1. Vid kromosomal semikonservativ replikation avlägsnas den korta 5 ’ RNA-primern från den framväxande strängen och gapet fylls i av DNA som ligeras till det intilliggande framväxande DNA. I slutet av kromosomen kan emellertid gapet efter avlägsnande av den 5’ terminala RNA-primern på den släpande strängen inte fyllas i, och kromosomen kan bli kortare med varje efterföljande replikationsrunda. Detta har kallats slutreplikationsproblemet (Watson, 1972; Olovnikov, 1973), och telomeras hjälper till att lösa detta problem (Greider och Blackburn, 1987; Soudet et al., 2014).

Semikonservativ replikation sker före telomeras verkan. Tidigare trodde man att DNA-replikation började vid ett ursprung i kromosomalt DNA intill telomerupprepningarna, med replikationsgafflarna som rör sig dubbelriktat bort från det subtelomera ursprunget (Fig. 1 A), vilket replikerar telomeren. Emellertid återstod frågan huruvida DNA-replikation kan initiera med viss frekvens inom själva telomeren (Fig. 1 B). Denna fråga har nu besvarats jakande i denna fråga av Drosopoulos et al., som använde enstaka molekylanalys av replikerat DNA (SMARD; Norio och Schildkraut, 2001). I detta tillvägagångssätt märks replikerande celler sekventiellt av två olika nukleotidanaloger som därefter identifieras genom immunofluorescens. Till exempel, i dubbelriktad replikering, kommer röda signaler från den första pulsen att flankeras i varje ände av gröna signaler från den andra pulsen. Tidigare rapporter med SMARD hade dragit slutsatsen att de flesta replikering initierar vid subtelomera regioner i mus och mänskligt genom och sällan i telomererna själva (Sfeir et al., 2009; Drosopoulos et al., 2012). I den senaste studien av Drosopoulos et al. (2015), fluorescens in situ hybridisering (FISH) med hjälp av sonder från telomerregionen gjorde det möjligt att analysera replikeringsmönstret för ett 320 kb genomiskt segment från slutet av muskromosomarmen 14Q. på grund av den långa tiden (4 h) för den första (röda) pulsen sågs vanligtvis bara röda signalkanaler inom telomeren, men eftersom många sådana molekyler inte hade den röda signalen sträcker sig in i den subtelomera regionen kan det bekvämt dras slutsatsen att replikation måste ha initierats inom telomeren (Fig. 1 B). Dessutom hade vissa molekyler röd signal i telomeren flankerad av grön signal, vilket stödde denna slutsats. Även om det i dessa fall fanns kromosom-proximal grön signal, sågs kromosom-distal grön signal sällan. Således, även om det fanns begränsade bevis för dubbelriktad replikation med ursprung i telomeren, är det mycket tydligt att ett replikeringsursprung kan existera inom telomeren korrekt med en replikationsgaffel som sträcker sig över tiden in i subtelomeren. Det återstår att undersöka om replikation initieras vid en relativt hög frekvens i telomererna av kromosomer andra än 14Q.

dessa fynd väcker frågan om ursprunget för DNA-replikation sammanfaller med den enkla sekvensrepetitionen som finns i telomerer eller istället om den sammanfaller med någon annan sekvens som kan vara interspersed inom telomeren. Den förstnämnda föreslås av en studie med Xenopus cellfria extrakt som kan montera förreplikationskomplexet och genomgå viss DNA-replikation på exogen DNA som uteslutande innehåller telomera upprepningar (Kurth och Gautier, 2010). Liknande slutsatser som DNA-replikation kan initiera i de enkla DNA-upprepningarna som finns i centromerer där replikationsbubblor har observerats i Drosophila virilis genom elektronmikroskopi har uppnåtts (Zakian, 1976), och en ny studie tyder på att DNA-replikation initieras inom humant alfa-satellit-DNA (Erliandri et al., 2014).

Replikeringsgafflar rör sig långsamt genom telomer DNA (Ivessa et al., 2002; Makovets et al., 2004; Miller et al., 2006; Sfeir et al., 2009) på grund av den höga termiska stabiliteten hos GC-rikt telomer DNA såväl som dess benägenhet att bilda stabila sekundära strukturer, såsom g-quadruplex (G4) DNA, vilket kan utgöra problem för DNA-replikation (Lopes et al., 2011; Paeschke et al., 2011). Olika helikaser hjälper till att lösa detta problem; till exempel hjälper Pif1-helikas till att varva ner G4 (Paeschke et al., 2013). Bloom syndrome helicase (BLM) och Werner syndrome helicase (WRN) har också varit inblandade i att hjälpa telomerreplikation: BLM undertrycker replikationsberoende bräckliga telomerer (Sfeir et al., 2009), och WRN undertrycker defekter i telomer-laggingsträngssyntes (Crabbe et al., 2004). Drosopoulos et al. (2015) rapporterar nu att Ledande strängsyntes som initieras inom telomeren har en långsammare progressionshastighet i subtelomeren i BLM-bristfälliga celler som visualiseras av SMARD. Dessutom var det en högre frekvens av replikeringsinitiering i 14Q-subtelomeren hos de BLM-bristfälliga cellerna, med ursprung närmare telomeren än i BLM-skickliga celler. Dessa observationer tyder på att vilande replikationsursprung i 14Q subtelomeren kan aktiveras när gaffelprogression hindras i BLM-bristfälliga celler (Fig. 1 C). Drosopoulos et al. (2015) fann också en ökning av subtelomer replikationsinitiering när replikationsgaffelprogression från telomeren hindrades av aphidicolin, som ett alternativt sätt att aktivera vilande ursprung genom replikationsspänning. När celler behandlades med G4-stabilisatorn PhenDC3 ökade 14Q subtelomer ursprungsbränning ytterligare i BLM-bristfälliga celler. Sammantaget tyder data på en avmattning av progressionen av ledande strängsyntes från ett ursprung i 14Q telomeren (med den G-rika föräldrasträngen som mall) när G4-strukturer inte kan lösas i BLM-bristfälliga celler. Som ytterligare stöd för en roll av BLM-helikas för att avlägsna G4-strukturer ökade färgning i BLM-bristfälliga celler av BG4-antikroppen (Biffi et al., 2013) mot G4 i hela genomet och särskilt i telomerer.

WRN-helikas kan varva ner G4 in vitro (Fry och Loeb, 1999; Mohaghegh et al., 2001). När Drosopoulos et al. (2015) använde SMARD för att analysera replikering i celler som var dubbelt bristfälliga av både BLM och WRN, de hittade en markant minskning av röd replikationssignal i 14Q telomerer, vilket tyder på en viss funktionell överlappning mellan BLM och WRN med avseende på Ledande strängsyntes av den g-rika strängen av telomerer. Som stöd för denna slutsats fanns det mer G4-färgning av BG4-antikroppen i celler som var dubbelt bristfälliga av både BLM och WRN än i celler som var bristfälliga av bara BLM eller bara WRN. Detta är den första direkta demonstrationen in vivo av ett bidrag av BLM-och WRN-helikaser i upplösningen av G4-strukturer, vilket är särskilt nödvändigt för progression av ledande strängsyntes som initierar i telomerer och kopieras från den g-rika strängen.