Brzy tuberkulózy monitorování léčby pomocí Xpert® MTB/RIF

Pro Redaktory:

Pokrok s cílem zlepšit kapacity laboratoří pro tuberkulózu (TB) diagnóza vedla k rozvoji molekulární testy, které jsou nyní nahrazuje konvenční mikroskopie a kultivační metody založené na velkém měřítku . Bohužel současné molekulární techniky detekují živé i mrtvé bakterie a pozitivní výsledek neznamená životaschopnost patogenu. DNA může skutečně přetrvávat po dlouhou dobu po bakteriální smrti a nukleová kyselina z mrtvých bakterií je stejně amplifikovatelná. Molekulární testy proto nejsou vhodné pro monitorování léčby a / nebo pro účely kontroly infekce.

zpráva o inovativní přístup k selektivní amplifikaci DNA získané z životaschopný Mycobacterium tuberculosis v klinických vzorků, což je užitečné pro sledování mykobakteriální zatížení v plicní pacientů s TBC během anti-TB.

protokol je založen na předběžné úpravě vzorků propidium monoazidem (PMA; Biotium Inc., Hayward, CA, USA), chemická sloučenina, která může interkalovat DNA neživotaschopných (nebo membránově poškozených) organismů, ale je vyloučena z životaschopných bakterií. Po aktivaci světla se PMA kovalentně váže na DNA a zabraňuje její amplifikaci pomocí PCR . Po vystavení světlu není nevázaný PMA schopen dále interagovat s molekulami DNA.

test byl nejprve optimalizován pomocí acidorezistentní bakterie (AFB)-negativní sputum vzorky označeny mrtvých nebo živých mykobakterií v různých koncentracích. Stručně řečeno, živé buňky Mycobacterium fortuitum byly přidány do vzorků sputa dekontaminovaného N-acetyl-cysteinem negativních na AFB mikroskopií nátěru v konečné koncentraci 106 bakterií * mL-1· Alikvot tohoto laboratorně vyrobeného vzorku byl zpracován tak, aby zahřál buňky M.fortuitum. PMA zásobní roztok byl připraven a skladován při -20°C a chráněn před světlem, až do použití, podle doporučení výrobců. PMA byl přidán jako pre-léčba v konečné koncentraci 500 µM a inkubuje 30 min při 4°C ve tmě, následuje světlo expozice na modré světlo-emitující dioda (LED)-aktivní světlo (GenIUL, Terrassa, Španělsko) po dobu 15 min při pokojové teplotě. DNA byla poté extrahována standardním postupem fenol chloroformu. Jako kontrolní zhodnotit účinnost působení světla krok, alikvotní nahá DNA extrahovaná z M. fortuitum kultury se smísí s 500 µM PMA dříve vystavena LED světlo pro 15 min. Komerční line-probe assay (Genotyp® Mycobacterium CM; Hain Lifescience, Nehren, Německo) byl pak proveden s cílem identifikovat klinicky významné mykobakteriální druhy . Vzorky obsahující živé m. fortuitum ukázal normální hybridizační profil na nitrocelulózové pásu, vzhledem k tomu, že vzorky zpracována tak, aby zabít bakterie nevykazovaly žádné zesílení, s výjimkou pro vnitřní kontrolu (údaje nejsou uvedeny). Od nahá DNA léčeni světlo-inaktivovaná PMA ukázal normální hybridizační profil, světlo, expozice krokem bylo efektivní a PCR byla dále inhibována zbytkové PMA.

S optimalizovaného protokolu pro inaktivaci DNA pocházející z mrtvých bakterií, přizpůsobili jsme to Xpert® MTB/RIF automatizovaný test (Cefeidy, Sunnyvale, CA, USA). Real-time PCR provádí Xpert® MTB/RIF poskytuje práh cyklů (Ct), které mohou být použity k vypočítat rozdíl v zesílení, výnos mezi vzorky s a bez PMA pre-léčba (ΔCt): nízké ΔCt indikuje přítomnost amplifikovatelný DNA z živé bakterie, vzhledem k tomu, že vysoké ΔCt naznačuje, že cílovou DNA ve vzorku pochází z mrtvé nebo poškozené bakterie, a proto, PMA pre-léčba významně ovlivňuje jeho zesílení. Pro výpočet hodnoty ΔCt jsme uvažovali průměr mezi hodnotami Ct poskytnutými pro každou sondu zahrnutou v testu Xpert® MTB/RIF (a až E).

Testovali jsme protokol PMA pomocí testu Xpert® MTB / RIF na CT kalibrační křivce AFB negativních klinických vzorků s teplem usmrcenými/živými mykobakteriemi přidanými v různých poměrech. Vysoké mrtvé živé poměry vedly k maximálnímu rozdílu hodnot ΔCt mezi tepelně ošetřenými a živými částmi s PMA, zatímco vzorky obsahující podobné procento usmrcených a živých bakterií nemohly být navzájem odlišeny použitím předúpravy PMA(údaje nejsou uvedeny). Podobné údaje byly hlášeny Kralik et al. .

nakonec jsme testovali přístup na klinických vzorcích. Do první validační studie bylo zařazeno 10 pacientů s diagnostikovanou aktivní plicní TBC (sputum smear positive a culture positive). Vzorky byly odebrány v době diagnózy (t0) a po 10-20 dnech terapie (t1), N-acetyl-cystein dekontaminovány a zpracovány pro MGIT-960 tekuté kultury (BD Diagnostické Systémy, Sparks, MD, USA) podle mezinárodních pokynů . Všichni pacienti byli stále AFB-pozitivní mikroskopií stěru sputa při t1. Souběžně bylo zpracováno 250 µL dekontaminovaných vzorků pro molekulární analýzu testem Xpert® MTB / RIF s předúpravou PMA i bez ní. Vzorky byly poté zpracovány podle pokynů výrobce pro test Xpert® MTB/RIF.

, Jak je znázorněno na obrázku 1, PMA neměla významně ovlivnit výtěžek PCR ze vzorků odebraných v čase t0 (průměr±sem ΔCt 2.3±0.5), vzhledem k tomu, že vzorky odebrané během terapie na t1 ukázal ΔCt 10,5±0.9 po PMA léčby (p=0.0003) potvrzuje, že sputum stěr pozitivity těchto vzorků byl způsoben především velmi poškozených bakterií. Navíc, ΔCt počítá mezi t0 a t1 v PMA-neošetřené vzorky bylo zjištěno, že být příliš nízká (ΔCt 2.9±0.9) ocenit skutečné snížení bakteriální zátěže v důsledku terapie.

Dva pacienty hodnocena jako „nízká“ v čase t0 u Xpert® ukázaly negativní kultury na t1, vzhledem k tomu, že všechny ostatní pacienty hodnocena jako „střední“ nebo „vysoké“ zůstal kultury pozitivní MGIT. I když přesný čas pozitivity, nemůže být posouzena, pozorovali jsme, že kultury ze vzorků odebraných v t1 se stala pozitivní přibližně 7-10 dnů později ve srovnání s kultur ze vzorků odebraných v čase t0, což naznačuje závažné snížení živé bakteriální zatížení.

všichni pacienti byli na konci léčby úspěšně léčeni a vyléčeni, což bylo v souladu s redukcí živých bakterií zjištěných testem PMA.

jako negativní kontrolu jsme retrospektivně zahrnuli také případ selhání léčby (AFB pozitivní a kultura pozitivní po 5 měsících standardní léčby). V tomto případě PMA Předúprava obou dekontaminovaných vzorků sputa odebraných po 1 měsíci a dvou během léčby významně neovlivnila výtěžnost PCR (ΔCt ∼2), což podporuje neúčinnost léčby proti TBC.

stejný protokol by v zásadě měly být kompatibilní s ostatními CE-schválené molekulární testy a line sonda testy schválila Světová Zdravotnická Organizace pro diagnostiku TB; další studie jsou zapotřebí tuto možnost vyloučit.

předchozí studie prokázaly možnost použití PMA k rozlišení mezi živými a mrtvými mykobakteriemi za použití koncentrace 25-50 µM. V protokolu nastaven, konečné koncentraci 100 µM zcela vyhnout amplifikace DNA získané z tepelně zabil M. fortuitum; slabý pozadí díky zesílení DNA z tepla-zabil M. tuberculosis byla pozorována (data nejsou zobrazena). Můžeme spekulovat, že různé složení buněčné stěny nějak ovlivňuje schopnost PMA proniknout poškozenými mykobakteriemi. Kralík a spol. pozorováno, že redukce signálu vyvolaná PMA mezi živými a mrtvými Mycobacterium avium subsp. paratuberkulóza byla nižší ve srovnání s těmi, které byly nalezeny u jiných bakteriálních druhů. Kromě toho, vzhledem k množství nečistot, které by mohly potenciálně sekvestrovat molekuly PMA v dekontaminované sputa, jsme zvýšili konečnou koncentraci na 500 µM. Další studie hodnotící rozdíly PMA léčebný účinek na kmeny, ukazuje různé buněčné stěny složení (např. Pekingu kmeny) a/nebo v sputa s různými vlastnostmi (např. sputum obsahující krev) by mohlo lépe objasnit užitečnost tohoto testu v různých klinických podmínkách.

podle Løvdala a kol. , malá část buněk, o nichž se předpokládá, že jsou mrtvé nebo těžce zraněné, není schopna růst. Přítomnost malého počtu buněk, které jsou silně zraněn, ale non-kultivovat mohl vysvětlit, proč stále máme pozitivní signál ve vzorcích odebraných na t1 i přes PMA pre-ošetření. Předúprava PMA se nevyhýbá detekci malého podílu mrtvých buněk (falešně pozitivní pro test životaschopnosti): test by proto mohl přeceňovat životaschopné mykobakterie. Z klinického hlediska by to však představovalo menší chybu ve srovnání s rizikem (velmi malým pro tento test) podcenění životaschopných mykobakterií.

Naše data naznačují, že pro první čas, že kvantitativní molekulární techniky v kombinaci s PMA metoda by mohla být alternativou k přímé mikroskopii a kultury pro monitorování časné léčebné odpovědi a pro předběžné hodnocení individualizované režimy. Použití tohoto testu může umožnit dřívější vyhodnocení účinnosti léčby, což ukazuje na jasné snížení vitální mykobakteriální zátěže. Absence odpovědi na léčbu však může být také okamžitě identifikována testem umožňujícím změnu režimu a omezujícím šíření infekce a další rozvoj rezistence .

• 2 ERS 2012