Embryo Projektu Encyklopedie

Od roku 1958 do roku 1961, Leonard Hayflick a Paul Moorhead v Usrozvinuté způsob, jak v laboratoři pěstovat kmeny lidských cellswith kompletní sady chromozomů. Dříve vědci nemohliustain buněčné kultury s buňkami, které měly dvě kompletní sadychromozomy jako normální lidské buňky (diploidní). V důsledku toho vědcibojoval ke studiu biologie lidských buněk, protože neexistoval spolehlivýzdroj buněk, které představovaly diploidní lidské buňky. V jejich experimentech, Hayflick a Moorhead vytvořili trvalé kmeny humancells, které si zachovaly obě kompletní sady chromozomů. Poté zmrazili vzorky z kultur tak, aby buňky zůstaly životaschopné pro budoucí výzkum. Oni také poznamenal, že buňky mohou dělit pouze v určitých časech, než jsou degradované a zemřel, což je jev, latercalled na Hayflick limit. Hayflickův a Moorheadův experiment umožnilvýzkum vývojové biologie a vakcín, které se spoléhaly na kmeny humancell.

Hayflick se specializuje na kultivaci buněk v kontrolovaném prostředí. V roce 1958 nastoupil do Wistar Institute ve Filadelfii v Pensylvánii, výzkumné instituce, která studovala buněčnou biologii aviry, na pozvání nového ředitele Ústavu Hilarykoprowského. Koprowski pověřil Hayflicka vytvořením buněčných kultur pro použití v experimentech jiných vědců v ústavu. Hayflicklater si však vzpomněl, že svůj výzkumný úkol použil jako příležitost ke studiu metod a omezení buněčných kultur. Toassist v kultivaci buněk, Hayflick rekrutoval jeho Wistar kolega,Paul Moorhead, kteří studovali strukturu a funkci buněk andchromosomes.

nedostatek dlouhověkosti normálních lidských buněčných kultur vlaboratoř omezila výzkum, který vědci mohli udělat. S cellcultures, vědci rostou populace buněk ve skleněných nádobách kontrolované podmínky pro použití ve výzkumu. Vědci obvykle growcell kultur na sklo nebo petriho miskách, které obsahují růstové médium,roztok obsahující rozpuštěné soli, cukrů, a dalších cellnutrients. V průběhu první poloviny dvacátého století,vědci předpokládali, že normální, zdravé buněčné kultury měl aninnate schopnost rozdělit na dobu neurčitou na základě dříve findingspublished tím, biolog Alexis Carrel v roce 1912 v USA. V praxi však vědci nepozorovali nekonečné dělení v normálních buňkách.Místo toho buňky v kultuře nakonec degradovaly a zemřely. Scientistsposited, že buňky degradována, protože oni měli vyčerpané culturegrowth středně všech jeho živin, nebo proto, laboratorytechnicians se nepodařilo udržet ideální podmínky životního prostředí forcellular růst. Pouze lidské buňky, které udělal rozdělit neustále inlaboratory nastavení, zvané nesmrtelné buněčné linie, byly buňky z rakovinných buněk. Tyto buněčné linie představovaly pouze některé aspekty biologie lidských buněk.

V polovině dvacátého století, medicalresearchers nedokázal vysvětlit, co způsobilo rakovinu, a mnoho vědců,včetně Hayflick a Moorhead, předpokládal, že určité virusesmight způsobit rakovinné výrůstky. Ačkoli mnoho mikrobiologů usedcells odvozené z nádorových buněčných linií v lékařském výzkumu, cellswere obecně ne použitý ve vývoji vakcín becausescientists obavy, že vakcíny by být kontaminovány thecancer-působit viry, případně obsažené v buňkách samotných. Kromě toho, buňky od nádorových linií, vzhledem k jejich constantdivision, byly heteroploid, což znamená, že mají buď větší orfewer počet chromozomů než normální lidské buňky, které mají twocomplete sady chromozomů. Heteroploidní buňky často vyplývajíkontinuální dělení buněk po mnoho generací buněk v kultuře.

Hayflick a Moorehead vyrábí lidských buněk, která by mohla becultivated po mnoho generací, jako rakovinné buňky z celllines, ale také zachovalé buňky diploidní počet chromozomů snížené riziko z teoretické rakovinu-působit viry. Popsali svůj experiment „the Serial Cultivation of Human DiploidCell Strains“, publikovaný v roce 1961.

Hayflick a Moorhead snažil rozvinout kmeny lidských buněk, která by mohla být pěstována na longperiods času v laboratoři ještě stále zachován jejich diploidnumber chromozomů. Oni předpokládali, že pokud se weretransplanted malé vzorky diploidní lidské buňky z již growingcultures do nového růstového prostředí, které by výrazně pomáhala řada diploidních buněk v kultuře. Hayflick a Moorhead navrhli, že zmrazení malých množství diploidních buněk by zastavilo růst a dělení buněk bez zabíjení buněk. Zmrazené buňky pak mohly být skladovány, dokud je vědci nepožadovali, v tom okamžiku mohli zmrazené buňky zmrazit a obnovit je do normální buněčné aktivity.Hayflick a Moorhead předpověděli, že po rozmrazení se tyto Kultivované buňky nestanou heteroploidními buňkami z jiných linií a zachovaly by si diploidní sadu chromozomů.

Hayflick a Moorhead’sexperiment zaměřené jak vytvořit metodu pro pěstování lidských diploidcells v laboratoři pro dlouhodobý výzkum použít, a determinewhether tyto buněčné kmeny přispěly k rakovinné výrůstky.Hayflick a Moorhead první rostla lidských buněk v laboratorních growthcultures, transplantované malé vzorky buněk do nové kontejnery togrow další buněčné kultury, a ztuhl vzorky buněk z thosecultures uchovat buňky pro pozdější výzkum. Dále otestovat, zdazmrazené buňky byly stále životaschopné pro výzkum, Hayflick a Moorheadrozmrazily zmrazené buňky a pokusily se z nich pěstovat buněčné kultury.Nakonec implantovali vzorky těchto lidských diploidních buněčných kmenů do živých tkání, aby zjistili, zda vedou k rakovinnému růstu.

developdiploid lidské buněčné kmeny, Hayflick a Moorhead začal cultivatingcells z 25 různých tkání citováno z potracených plodů. Těmito buňkami se stalo 25 různých kmenů lidských buněk, pojmenovaných numericky WI-1 prostřednictvím WI-25. Wistar Institute, kde byly vyvinuty buňky. Hayflick a Moorhead používá plodu tissuesbecause, více než dospělé buňky, buňky plodu snadněji developedinto fibroblastů buněk, které jsou specializované buňky, které providestructural podporu většiny tělesných tkání. Fibroblastové buňky byly vhodné pro kultivaci laboratorních buněk, protože rostly rychle a nepřetržitě v buněčných kulturách a poskytovaly množství buněk pro výzkum. Hayflick a Moorhead řez každý ze vzorků tkáně intosmall, tenké třísky a pak implantovat je na vnitřní stěně glassbottles plná živin-bohaté růstového média. Hayflick a Moorheadpak umístili tkáňové potažené lahve každého buněčného kmene do válečného prostředí po dobu tří dnů, pravidelně nahrazující růstové médium čerstvou zásobou, začít růst buněčné kultury.

Hayflick andMoorhead nechte kultury růst, dokud buňky nepokryjí celou skleněnou láhev. Každý vzorek plodových buněk byl poté rozdělen procesemnazvaná subkultivace. Během subkultivace, Hayflick a Moorheadodstranili malý vzorek buněk a implantovali tyto buňky na stěnu nové skleněné láhve naplněné růstovým médiem, vytvoření nové buněčné kultury stejného buněčného kmene. Každá nová buňka cultureconstituted nová generace buněk, který by mohl být sám o sobě furthersubcultivated stejnou metodou, umožňující celkový počet cellsto rostou exponenciálně. Hayflick a Moorhead pak rozdělili vzorky zbývajících buněk na malé části a zmrazili je, aby zastavili růst buněk a zastavili jakékoli další dělení buněk.

Hayflick a Moorheadpokračovaly v subkultivačních buňkách dvakrát týdně po dobu asi deseti měsíců, kdy buněčné kultury přestaly růst a začaly se degradovat.Hayflick a Moorhead předpokládali, že buňky se přestaly dělitkvůli hromadění toxických produktů buněčného růstu vrůstové médium. Hayflick a Moorhead snažil zavést čerstvé growthmedium to bylo bez případných toxinů, ale buňky culturescontinued rozkládat a umírat v průběhu několika příštích měsíců. Jiné buněčné kultury umístěné ve stejném růstovém médiu se však nedegradujía zemřít. Vědci dospěli k závěru, že něco o buňkáchsami, nikoli jejich prostředím, způsobily, že se začaly zhoršovat.

Hayflick a Moorhead se dále pokusili zjistit, zda buňky, které zmrazili, mohou být stále použity k růstu více buněčných kultur. Po rozmrazení malých vzorků buněk, Hayflick a Moorheadimplantoval buňky na stěny skleněných lahví. Oni againcultivated jim v růstu média a zjistil, že i afterfreezing, buňky stále rostl v nových kultur, což by mohlo themselvesbe subcultivated. Bez ohledu na předchozí zmrazení nebo subkultivace mohli vědci použít vzorky z diploidních lidských buněčných kultur k růstu diploidních lidských buněčných kultur. Hayflick a Moorhead vytvořili adiploidní lidský buněčný kmen, který mohl být pěstován v laboratorních kulturách na neurčito.

Hayflick a Moorhead pak zkoumali, zda buňky vypěstované v nových kulturách nebyly diploidní. Když writingabout experiment, říkali, že mají obavy z toho, že thecells nemusí zůstaly diploidní, protože měli pěstuje je overmany generací, což může vést k heteroploidy. Pomocí lightmicroscopes, Hayflick a Moorhead se podíval na vzorky buněk v metafázi buněčného dělení, kdy chromozómy jsou odlišné andeasily viděn. Počítali počet chromozomů v 250individuálních buňkách, aby získali odhad, kolik buněk má stále adiploidní počet chromozomů. Hayflick a Moorhead to určilivíce než 97 procent buněk bylo diploidních i po více než dvaceti generacích subkultivace. Hayflick a Moorhead závěr je proces sériové kultivace a zmrazení buněk plodu byl aneffective metoda pro zachování diploidní lidské buňky kmene.

nakonec Hayflick a Moorhead potřebovali ukázat, že jejich buněčné kmeny nezpůsobujízpůsobují rakovinu. Problém s nesmrtelné buněčné linie vytvořené fromcancer buňky bylo, že vědci předpokládali, že buňky mightcontain rakovinu-působit viry. Aby se ujistil, že jejich novébuněčné kmeny nezpůsobily rakovinu, Hayflick a Moorhead testovali buněčný kmenwi-25 v živé tkáni. Vybrali kmen WI-25, protože prošel nejvíce subdivizemi a byl nejpravděpodobnějším kmenem buněk způsobujícím rakovinu. Proto, pokud tomu tak není, bylo pravděpodobnéže žádný z ostatních kmenů by také.

vědci implantovalibuňky z buněčného kmene WI-25 do lícních sáčků pěti žijících křečků. Jako experimentální kontrolní skupina také implantovali pět dalších křeččích lícních sáčků s buňkami odvozenými z rakovinných buněčných linií. Nejprve se objevily uzliny, časné známky vývoje rakovinyv kontrolních sáčcích obou sad křečků. Po třech týdnech však téměř všechny uzliny u křečků implantovaných pomocí WI-25cells zmizely, zatímco uzliny u křečků implantovaných pomocí buněk z rakovinných buněk se zvětšily. Hayflickand Moorhead provedli biopsie zbývajících uzlů, aby potvrdilijejich předpověď, že jejich subkultivované buňky nezpůsobily rakovinu.Biopsie ukázaly, že uzliny u křečků implantovaných buňkamiz rakovinných buněčných linií byly skutečně rakovinné, zatímco buněčné uzliny WI-25 byly způsobeny zánětem a krvácením na implantacimísto.

Hayflick a Moorhead také implantovali podobnou lidskou buňku WI-1 do svalové tkáně pěti umírajících pacientů s rakovinou.Také implantoval buňky z rakovinných buněčných linií do pěti dalších pacientů s rakovinou. Stejně jako u křečků se nejprve zvětšily uzliny na implantačních místech obou skupin. Po několika dnech začaly uzliny buněk Wi-1 ustupovat, zatímco uzliny se množily u pacientů implantovaných buňkami z rakovinných buněčných linií. Na konci týdne téměř všechny uzly WI-1 zmizely a Hayflick andMoorhead biopsovali zbývající uzly v obou skupinách. Výsledky biopsie ukázaly, že rakovinné buněčné uzliny byly heteroploidní buňky, zatímco WI-1 uzliny byly diploidní a nerakovinné. Hayflickand Moorhead je zjištění, které publikoval v roce 1961, demonstratedthat lidských diploidních buňkách by mohla být rozšířena po mnoho generací,jako rakovinné buněčné linie, aniž by se stal heteroploid nebo cancerousthemselves.

výsledky měly okamžitý a trvalý dopad na vývojovou biologii a vědecký výzkum. Výsledky jejich experimentu potvrdily carrelovu hypotézu z roku 1912, že buňky v kultuře rostly donekonečna, navzdory pozorování buněčných kultur se postupem času degradovaly. Carrel navrhl, že v praxi se zdá, že se buňky zhoršují a věk přesčas byl způsoben nedokonalými laboratorními růstovými podmínkami buněk.Carrel tvrdil, že za ideálních podmínek by buňky v kulturách mohlyrozdělovat se donekonečna a účinně působit jako nesmrtelná buněčná linie.Hayflick a Moorhead je zjištění, nicméně uvedl, že stárnutí inorganisms se stane na buněčné úrovni, proces zvaný stárnutí buněk,a to buňky procházejí pouze omezený počet divizí bude trvat degradován a zemřel. Během svého experimentu Hayflick a Moorheadpokusil se neustále kultivovat fetální buňky a nahradit starý růststřední s čerstvým médiem bohatým na živiny. Zjistili však, že po asi čtyřiceti nebo šedesáti generacích začaly buňky spíše umíratnež reprodukovat, fenomén později nazývaný Hayflickův limit. Výsledek ukázal, že buňky nemohou růst donekonečna v kultuře, a to ani za ideálních podmínek.

Hayflick a Moorhead je ukládání sériové pěstování lidských diploidních buňkách také pomohl vědcům tomaintain zásobu diploidní lidské buňky pro výzkum. Podle výpočtů hayflicka a Moorheada by jediný kmen lidských buněk mohl být dostatečně subkultivován, aby vyprodukoval téměř 20 tun životaschopných buněk. I když to není technicky nesmrtelné, tato dodávka by byla pro praktické výzkumné účely nevyčerpatelná.

navíc vytvoření životaschopných diploidních lidských buněk umožnilo výzkum vakcín.Protože Hayflick a Moorhead ukázala, že jejich lidské buněčné kmeny didnot způsobit rakovinu u křečků nebo lidé, ty kmeny by mohly být použity invaccines bez hrozby kontaminace vakcíny s somecancer-působit agent. Následné podobně odvozené kmeny lidských buněk, jako je WI-38, se staly základem pro vakcíny proti dětským chorobámjako jsou zarděnky a plané neštovice.

Zatímco mnozí vědci uvítala rozvoje lidských buněk kmenů Hayflick a Moorhead, někteří,včetně Katolické Církve, nesouhlasil použití přerušena fetalmaterial ve vývoji očkovacích látek z náboženských důvodů. TheVatican později uvedl, že vznesli námitky proti způsobu vývoje vakcín odvozených z fetálních tkání, nikoli proti použití těchto vakcín k prevenci nemocí.

Hayflick a Moorhead demonstratednot pouze to, že lidské buňky mohou být úspěšně pěstována v thelaboratory při zachování diploidní počet chromozomů,ale také to, že mohli udržovat buňky téměř indefinitelythrough sériové subcultivation. Kromě toho jejich experiment položil základ pro Hayflick k dalšímu výzkumu limitu buněčného dělení v kultuře, později nazvaný Hayflick limit. Hayflick a Moorhead’sdiscoveries povoleno pro další experimenty ve vývojové biologyand vývoj vakcíny tím, že poskytuje bohaté lidských buněk, výzkum.