Lithium chloridu sodného účinně zabíjí med včelí parazit Varroa destructor pomocí systémového účinku

Pilotní studie: Z RNAi na chlorid lithný

V pilotní studii, roztoče-zamořené včely byly v klecích a krmena cukrový sirup obsahující dsRNAs potenciálně zásadní Varroa geny (Doplňková Tabulka S1). Prostý sirup, sacharóza (neléčí) a sirup s dsRNA na základě kódování sekvence pro zelený fluorescenční protein GFP (dsGFP ctrl) sloužily jako kontroly. GFP je exprimován v bioluminiscenční hydrozoanové medúze Aequorea victoria. Sekvence GFP byla vybrána jako kontrola, protože v genomu včel nebo roztočů Varroa neexistuje žádný homologní gen. V neléčené skupině byla mortalita roztočů < 5%. V kontrastu, všechny roztoče na včelách, které obdržel roztoku sacharózy obsahují dsRNA cílení Varroa geny byly efektivně zabil během tří dnů. Stejný účinek na roztoče však byl pozorován v kontrolním experimentu, ve kterém byly včely krmeny GFP dsRNA (Doplňkový obr. S1). Tyto výsledky vyloučily navrhovaný mechanismus zprostředkovaný RNAi, ale naznačily buď dosud neznámý účinek RNA, nebo aktivitu dalších složek v testovaném roztoku. Jak vysoké koncentrace chlorid lithný (LiCl) byly použity při výrobě dsRNAs a proto fed včely spolu s dsRNA, jsme se rozhodli krmit LiCl v roztoku sacharózy, aby se v kleci včel otestovat své činnosti proti roztoči Varroa. Pozoruhodné je, LiCl v koncentracích 25 mM, což odpovídá vypočtené koncentrace dsRNA řešení, zabít roztočů stejně efektivně jako látky, jež obsahují dsRNA. Navíc, po LiCl byl do značné míry odstraněn z dsRNA rozsáhlé praní (prát dsGFP ctrl), miticidal aktivita byla podstatně snížena, jak je uvedeno po zpožděný nástup a snížené aktivity (Doplňkový Obr. S1). Z těchto údajů jsme dospěli k závěru, že LiCl, ne RNA povalení, zprostředkované pozorované činnosti o roztoči Varroa a že by stálo za to analyzovat potenciál LiCl jako varroacide.

Efektivní koncentrace chlorid lithný

potvrdit základní vyjádření naší pilotní studii jsme zjistili, klec experimenty s různou koncentrací LiCl pro robustní statistické analýzy. Kromě koncentrace 25 mM, u které bylo zjištěno, že je účinná v pilotní studii, jsme použili koncentrace 2 mM, 4 mM a 10 mM, abychom určili nižší práh účinnosti. Výsledky podporují závěry z předchozí studie a prokázaly významné miticidal účinky pro LiCl koncentrace tak nízké, jak 2 mM, na které podstatné zvýšení roztoče úmrtnost (P < 0.001, log-rank test; Doplňující Tabulky S2) bylo prokázáno. Vyšší koncentrace 10 mM a 25 mM výrazně lepší roztoče úmrtnosti začíná na den dva léčbu a dosáhnout vyhlazení více než 96% léčených roztočů na konci experimentu (Obr. 1a, doplňková tabulka S2). V kontrolní experimenty bez LiCl v krmení řešení, roztoče úmrtnost dosáhla v průměru 9,3% a byla proto dobře v rozmezí úmrtnosti získaná pro roztoče stále na neošetřené klec včely v různých environmentálních conditions33. Na základě těchto výsledků jsme potvrdili jasnou vliv LiCl na roztoče životaschopnost v koncentračním rozmezí 2 mM a 25 mM.

Úmrtnost phoretic roztoči Varroa a včely po krmení chlorid lithný (LiCl), aby v kleci včely. (a) Kaplan-Meierovy křivky přežití ženské roztoči Varroa držel v kleci včely krmena LiCl v koncentracích mezi 2 mM–25 mM (n = 33, 9, 9, 12 a 9 klece pro 0 mM (kontrola), 2 mM, 4 mM, 10 mM a 25 mM, v tomto pořadí). U všech koncentrací, přežití roztočů v léčebných skupinách byla výrazně liší od kontroly (P < 0.001, log-rank test s Bonferroniho korekcí). b) Kaplan-Meierova křivka přežití včel v kleci a samic roztočů Varroa po 24 hodinách expozice LiCl (n = 9 klecí). Přežití roztočů v léčené skupině významně liší od kontrolní skupiny (P < 0.001, log-rank test), ale tam byly žádné významné skupinové rozdíly v úmrtnosti včel.

V těchto experimentů, v kleci včely byly krmeny s příslušnou koncentraci LiCl v průběhu několika dní, dokud všichni roztoči byli zabiti léčby. Pro potenciální použití ve včelařské praxi by však byla vhodnější kratší a definovaná doba ošetření. Proto jsme provedli další experiment, ve kterém je nejúčinnější koncentrace 25 mM LiCl (obr. 1a) byl podáván po dobu 24 hodin a následovalo krmení roztokem cukru po dobu dalších šesti dnů. Na konci pozorovacího období, 92.9% roztočů (n = 225 roztočů, P < 0,001, log-rank test) bylo usmrceno bez významného účinku na ošetřené včely (viz následující odstavec). Tento výsledek jasně ukazuje, že i krátkodobé krmení 25 mM LiCl je dostatečné k podstatnému snížení populace roztočů.

přesně určit požité množství LiCl o včely, které je nutné zabít parazitujících roztočů, 12 nově vylíhlé včely byly uměle živené 10 µl LiCl řešení 4 mM do 100 mM a vedeny individuálně s phoretic roztoče na pět dní do klece. S 4 mM a 10 mM řešení, které odpovídalo příjmu 1,7 µg a 4,2 µg LiCl, respektive, efekt byl výrazně neliší od neošetřené kontroly (n = 12 roztoči, P = 1.000, log-rank test, Doplňující Tabulka S3). Nicméně, jedna dávka je 25 mM, což odpovídá 10,6 µg LiCl spotřebované včelí stačila zabít 100% phoretic roztočů do 48 hodin (Obr. 2).

Úmrtnost phoretic roztoči Varroa stále na včely, které byly individuálně fed 10 µl lithium chloridu sodného v koncentracích v rozmezí od 4 mM do 100 mM. Včely byly krmeny LiCl pouze jednou na začátku experimentu, pak se jim dostalo sacharózy sirupu po dobu pěti dnů. Pro každou koncentraci bylo analyzováno 12 klecí s jednou včelou a jedním roztočem Varroa. Přežití roztočů bylo významně sníženo ve srovnání s kontrolní skupinou, když byly včelám krmeny koncentrace 25 mM a vyšší (P < 0,001, log-rank test).

Účinky na včely dělnice

Pro analýzu snášenlivost LiCl, aby včely dělnice, test klecích, které byly použity k analýze roztoče úmrtnosti (Obr. 1a) byly dodatečně zaznamenány pro úmrtnost dělnických včel. Po expozici 2 mM, 10 mM a 25 mM LiCl, které bylo prokázáno, že vyvíjet miticidal činnost, ošetřené pracovník včelí úmrtnosti pohybovala v průměru od 3 do 7% za různých krmení skupiny. S výjimkou 10 mM LiCl skupiny (n = 12 klece, P = 0.015, log-rank test; Doplňující Tabulky S4), byly hodnoty výrazně neliší od 4% úmrtnosti v neléčené kontrolní skupiny. Navíc úmrtnost našich ovládací prvky byly v dosahu úmrtnost neléčené klec včely nutná jako kontrola v toxikologii tests34, proto potvrzující platnost našem testovacím systému. Také 24hodinová léčba LiCl neovlivnila úmrtnost dělnických včel (obr. 1b; n = 9 klecí, P = 0,308, log-rank test). Dobrá snášenlivost LiCl vůči včelám byla také potvrzena krmením jedné dávky (pro úmrtnost roztočů viz obr. 2) to nevyvolalo významné zvýšení úmrtnosti včel pracujících (P = 1.000, log-rank test; doplňková tabulka S5).

Next, různé koncentrace LiCl byl kontinuálně přiváděn do poslední kleci včelí zemřel, aby prošetřila reakci na dlouhodobé expozici. Tady, léčba výrazně snížila průměrná životnost čerstvě vylíhlé dělnice z 26 dní v neošetřené kontrolní klece na 23 a 22 dní pro 2 mM a 10 mM LiCl, respektive (n = 60 včely, P = 0.024, log-rank test; Doplňující Tabulka S6). U včel, které dostaly nejvyšší koncentraci 25 mM LiCl, byla životnost v průměru významně snížena na 19 dní (obr. 3a).

Úmrtnosti včel po krmení chlorid lithný, aby v kleci včely. a) Kaplan-Meierova křivka přežití včel v kleci během chronické expozice LiCl. LiCl diety v koncentracích 2 mM, 10 mM a 25 mM byly krmeny ad libitum až do smrti poslední včely (n = 6 klecí po 10 včelách). Přežití všech léčených skupin bylo významně odlišné od kontroly cukrového sirupu (p < 0,01, log-rank test s korekcí Bonferroni). b) Kaplan-Meierova křivka přežití dělnických včel v kleci po 24hodinové expozici LiCl. LiCl diety při koncentracích 2 mM, 10 mM a 25 mM byly krmeny ad libitum pro prvních 24 h po vylíhnutí a pak nahrazena sacharózy sirupu (n = 12 klecí s 10 včely každý). Přežití všech léčených skupin významně nelišil od cukrového sirupu kontroly (P > 0.1, log-rank test s Bonferroniho korekcí).

Nicméně, LiCl se zdá bránit včel životaschopnost pouze, jsou-li podávány po delší dobu, jak ukazuje další experiment, ve kterém LiCl byla krmena pro prvních 24 h po vylíhnutí a pak byl nahrazen sacharózy sirupu, dokud poslední v kleci včelí zemřel (Obr. 3b). Tady, průměrná životnost čerstvě vylíhlé dělnice v rozmezí od 22 dnů (10 mM) až 24 dnů (kontrolu), bez významných rozdílů mezi způsoby léčby (n = 120 včel na léčbu, P ≥ 0.126, log-rank test; Doplňující Tabulka S7). Na základě těchto údajů z klecových včel jsme dospěli k závěru, že i krátkodobá léčba LiCl postačuje k úplné eradikaci zamoření roztoči Varroa s malým nebo žádným dopadem na životaschopnost pracovních včel. Tyto výsledky získané v klecových testech za kontrolovaných podmínek představují úspěšný a slibný první krok k novému přístupu k léčbě Varroa. Účinnost a vedlejší účinky však musí být potvrzeny v terénních podmínkách.

testy v Terénu s lithium chlorid v umělé roje

Pro přibližné terénu, testovali jsme 25 mM a 50 mM LiCl v devět rámků-zdarma umělé roje se skládá z královna a přibližně 20.000 včel každý. Tyto koncentrace byly zvoleny na základě předchozích experimentů s kleci včely pomocí nejvyšší dávka, která byla stále tolerován včely v krátkém aplikaci krát (25 mM). Protože rovnoměrné rozdělení sacharózy sirupu po celý umělý roj přibližně 20.000 včel mohlo být obtížné dosáhnout, jsme navíc testovali 50 mM koncentrace LiCl, aby zajistily, že každá včela byla vystavena dostatečné množství lithia. Proto roje byly krmeny ad libitum s sacharóza, sirup obsahující 25 mM LiCl (n = 6) nebo 50 mM (n = 3) po dobu tří dnů, následuje lokální aplikace Perizin®. Perizin® obsahující organofosfát coumaphos jako účinnou látku, je vysoce účinný varroacid, který se běžně používá jako kontrolní léčba35. Mortalita roztočů byla sledována po dobu pěti dnů. Před kontrolní léčbou 25 mM LiCl usmrtilo přibližně 90% roztočů přítomných v umělých rojích (Tabulka 1). Vyšší koncentrovaný roztok (50 mM) však tento účinek nezvýšil (χ2 test, P = 0,953). Celkově byla účinnost poněkud nižší ve srovnání s klecovými testy. Jedním z vysvětlení může být, že rozdělení LiCl v clusteru tisíce včel vyžaduje více času, až poslední jedinec včela spotřebuje v dostatečné dávce zabít příslušných parazitujících roztočů. Potřebná doba krmení tak obrovských entit 20 000 včel a více musí být analyzována v dalších experimentech.

Účinnost jiných sloučenin lithia a non-soli lithia

potvrdit lithium jako aktivní součást pro vliv na roztoči Varroa jsme testovali řadu sloučenin lithia a ve srovnání miticidal účinky s non-soli lithia. Zvláštního zájmu byly lithium-citrát, sloučenina se třemi ionty lithia, lithium, síran a uhličitan lithný, které mají dvě lithiové ionty, ve srovnání s pouze jeden lithium ion v LiCl. Další sloučeniny s jednou lithium-ion (lithium laktát, lithium acetát), ale různé rozpustnost, chemické reaktivity a cena byla zahrnuta, aby analyzovala účinnost a snášenlivost ve srovnání s LiCl. V klecových experimentech všechny sloučeniny eliminovaly 100% roztočů při 25 mM během tří (citrát lithný a octan lithný) až čtyř dnů (síran lithný, laktát lithný a uhličitan lithný). Také, 4 mM zkušební roztoky, zcela zabil phoretic roztočů do pěti (lithium-citrát, lithium-sulfát, a lithium acetát) až sedmi dní (lithium laktát), s výjimkou uhličitanu lithia (Tabulka 2; Doplňující Tabulka S8).

dělnice mortalita byla významně zvýšená u obou koncentrací ve srovnání s variantou bez ošetření včel, s výjimkou 25 mM lithium-sulfát a 25 mM lithium laktát (Doplňující Tabulka S9). Pomocí těchto experimentů bychom mohli potvrdit, že jiné sloučeniny lithia mají podobný potenciál pro použití jako systémový akaricid. To by mohlo zvýšit flexibilitu pro případnou konstrukci veterinárního přípravku. Vzhledem k ceně jsou chlorid lithný a citrát lithný nejlevnějšími sloučeninami. Síran lithný je méně vhodný kvůli nižší snášenlivosti včel a uhličitanu lithného kvůli relativně nízké rozpustnosti ve vodě.

zkoumat závislá na koncentraci účinnost lithium sloučeniny podrobněji, jsme LiCl v porovnání s lithium-citrát (Li3C6H5O7), který měl největší rozdíl v množství lithiových iontů na molekulu, na pět různých koncentrací v rozmezí 1 mM–25 mM. Všechny koncentrace lithia citrát vykazovaly výrazně vyšší akaricidní aktivity ve srovnání s LiCl, ale tam byl žádný rozdíl v úmrtnosti včel (Tabulka 3, Doplňkové Tabulky, S9 a S11). Citrát lithný proto může představovat ještě lepší účinnou látku.

lithium-free ovládání a vyloučit sodný jako aktivní agent testovali jsme také alkalické soli chlorid sodný (NaCl) a chlorid draselný (KCl) a také chlorid hořečnatý (MgCl) na 25 mM. Jsme neměli pozorovat varroacidal vliv na NaCl nebo KCl (n = 3 klece, P = 1.000, log-rank test, Doplňkové Tabulky S12). V testech s MgCl 100% klecových včel uhynulo během pěti dnů (p < 0.001, log-rank test) a podle klesajícího počtu včel byl experiment ukončen dříve, než bylo možné analyzovat účinek na roztoče. Na základě těchto experimentů jsme dospěli k závěru, že lithium skutečně zprostředkovává akaricidní aktivitu v závislosti na dávce a že lithium citrát exponáty nejvíce příznivé vlastnosti všech sloučenin testovali tak daleko.

Potenciál lithiové sloučeniny jako nové varroacide

Jsme ukázali, že nejsou původně předpokládal, dvouvláknová Rna proti základním Varroa geny, ale překvapivě soli lithia zprostředkovat silný akaricidní účinek na roztoči Varroa na kleci včely a v umělé roje. Tyto výsledky tedy ukazují, že sloučeniny lithia představují novou třídu akaricidních činidel s vynikajícím potenciálem a pozoruhodně dobrou snášenlivostí včel. Různé citlivosti na roztoče a včely LiCl je ještě pozoruhodné vzhledem k tomu, že v důsledku zředění účinky, koncentrace LiCl v haemolymph včel bude pravděpodobně podstatně nižší, než koncentrace krmení pro včely.

důležité je, že naše zjištění neznamenají, že akaricidní účinky přístupů založených na RNAi, jak publikoval Garbian et al.32 jsou obecně zprostředkovány LiCl. Po krmení směsi dsRNA včelám po dobu 60 dnů, Garbian et al.32 zaznamenal pomalý nárůst mortality roztočů s konečnou účinností léčby pouze 60%. Vzhledem k rychlé a efektivní reakci našeho umělé roje na ošetření s LiCl, různé režimy činnosti jsou pravděpodobné: zatímco RNAi zprostředkované účinky se zdají vyvíjet dlouhodobé účinky, lithiové sloučeniny představují nezávislý mechanismus s rychlým nástupem a vysokou účinnost.

jako varroacid LiCl zobrazuje některé funkce, které jsou v této kombinaci jedinečné: (i) LiCl působí systémově prostřednictvím honey bee krmení („easy-to-použít“), (ii) je ve vodě rozpustný a proto nebude hromadit v včelí vosk, což je zásadní problém pro dlouhodobou léčbu pojmů pomocí syntetické varroacides s lipofilní properties36,37 (iii) orální toxicita většinu lithiových sloučenin pro savce je relativně low38 (iv) nemá repelentní účinek na krmení řešení v rámci příslušné koncentrační rozmezí 2-25 mM39 a (v) je k dispozici za mírné ceny. Velmi nadějná je skutečnost, že jedna aplikace pouze 10 µl roztoku LiCl v 25 mM roztoku (odpovídá dávkování 10,6 µg LiCl) jednotlivé včelí je dostačující zabít phoretic roztočů. Výzvou pro další výzkum bude vývoj inteligentní aplikační techniky pro roje a kolonie plné velikosti, aby se zajistilo, že všechny včely obdrží kritické množství účinné látky.

v Současné době nevíme, jak LiCl zabíjí phoretic roztoči Varroa, a existuje jen málo publikací o účinku LiCl v insects40. V lidské medicíně, lithium se používá od roku 1870 a je nálada-stabilizující činidlo indikován k léčbě manických epizod a jako udržovací léčba pro bipolární disorder41. S ohledem na jejich terapeutické použití byly sloučeniny lithia a jejich toxický profil pečlivě zkoumány. Doposud byla jako potenciální cíle navržena řada enzymů působících na metabolismus, vývoj, hematopoézu a další procesy42,43. Tyto enzymy vyžadují kovové ionty a lithium působí jeho aktivity v nekonkurenceschopná způsobem, který s největší pravděpodobností dochází přemísťovat dvojmocný kation. Je pravda, že v současné době nemáme žádné náznaky, že pozorovaný miticidní účinek sloučenin lithia závisí na srovnatelném způsobu působení.

jsme si také vědomi skutečnosti, že naše výsledky představují pouze první krok k vývoji nového veterinárního přípravku. Polní testy ve volně létajících koloniích jsou stejně nezbytné jako analýza subletálních a dlouhodobých vedlejších účinků na dospělé včely a medonosné včely a možné problémy se zbytky v medu.

Nicméně, výsledky jsou zde prezentovány již naznačují, že LiCl má potenciál jako efektivní a snadno-to-použít zacházení pro umělé a přírodní roje a to zejména pro obrovské množství balení včely používají k opylování ve Spojených Států11,44. Kromě toho by objasnění mechanismu účinku mohlo otevřít nové cesty pro cílený vývoj veterinárních přípravků pro boj proti roztočům Varroa.