PMC
Double-strand breaks in DNA může způsobit zmatek v buňkách, pokud není opraveno. Proto bylo navrženo, že na koncích chromozomů mohou být specializované cap struktury, které nejsou rozpoznány jako dvojité zlomů, čímž brání zatčení buněčného cyklu, degradace a recombinational fusion (Muller, 1938; McClintock, 1939). Nyní víme, že telomery obsahují konce chromozomů a jsou nezbytné pro stabilitu genomu. Telomery se skládají z tandemových opakování od hlavy k ocasu krátké sekvence bohaté na G; například lidské telomery jsou 2-20 kb (TTAGGG)n opakování. Na koncích chromozomů nejsou tupé, a 3′ konce (G-bohaté vlákno) přesahy v jediný pramen, který může napadnout interiéru telomer přemístit vnitřní G-bohaté sekvence a tvoří T-loop struktury (Griffith et al., 1999; Cesare a kol., 2003; Doksani a kol., 2013), čímž chrání konce chromozomů před rozpoznáním buňkou jako dvouvláknové zlomy, kromě ochrany proteiny, které váží telomeru.
Eukaryotické chromozomy jsou duplikovány přes semiconservative replikace s vedoucí (kontinuální syntézu pro čistý růst na 3′ konci rodící leading strand) a zaostává (nespojité Okazaki fragment syntézy pro čistý růst na 5′ konci rodící zaostávající strand) prodlužující pramen, jak je znázorněno na Obr. 1. V chromozomální semiconservative replikace, krátké 5′ RNA primer je odstraněn z rodící pramen a mezera je vyplněna pomocí DNA, která je ligován do přilehlé vznikající DNA. Nicméně, na konci chromozomu, mezera po odstranění 5′ terminál RNA primer na zaostávající strand nemůže být vyplněn, a chromozomů se může stát kratší s každou následující kolo replikace. To byl nazývaný end-problém replikace (Watson, 1972; Olovnikov, 1973), a telomerázy pomáhá řešit tento problém (Greider a Blackburn, 1987; Soudet et al., 2014).
replikace DNA na konci chromozomů. (A) replikace DNA může iniciovat v rámci subtelomeric regionu s replikační vidličky (zelené šipky) pokračuje obousměrně od původu. Telomerní DNA je replikována replikační vidličkou, která prochází touto oblastí. V každém panelu, což vede rodící strand synthesis je indikován modrou čáru s jedním arrowhead; zaostává rodící strand synthesis je indikován modrou čáru s více hroty šípů. V horní části každého panelu, červená čára označuje signál viděn mikroskopie replikace, který inicioval a nadále při podání první puls (IdU, červená) a tečkovaná zelená čára označuje signál viděn pro replikaci rozšíření během druhé puls (CldU, zelená). (B) na některých molekulách DNA z myšího chromozomu 14q se replikace DNA iniciuje v samotném telomeru. V praxi nebyl v telomere často pozorován druhý (zelený) puls. (C) Částečně se překrývající funkce BLM a WRN helicases jsou použity k vyřešení G-quadruplex (G4), DNA (modrá struktury), které mohou tvořit na G-bohaté rodičovské vlákno telomery. V buňkách deficientních na BLM a/nebo WRN helicase, progrese rodící přední pramen v telomer je narušena; zpomalil replikační vidličky jsou označeny červenými šipkami. Výsledný replikační stres je doprovázen aktivací počátků spící replikace v subtelomeře. Karikatura je nakreslena ve správném měřítku, a zřídka používané subtelomeric replikace původu v C je blíže k telomer než subtelomeric původu v. A.
Semiconservative replikace dochází před působení telomerázy. Dříve to bylo si myslel, že DNA replikace začal na původ v chromozomální DNA přiléhající k telomer opakuje, s replikační vidličky pohybuje obousměrně od subtelomeric původu (Obr. 1 A), čímž replikuje telomeru. Otázkou však zůstalo, zda replikace DNA může iniciovat s určitou frekvencí v samotném telomeru (obr. 1 B). Na tuto otázku Nyní kladně odpověděli drosopoulos et al., který použil analýzu replikované DNA s jednou molekulou (SMARD; Norio a Schildkraut, 2001). V tomto přístupu jsou replikační buňky postupně značeny dvěma různými nukleotidovými analogy, které jsou následně identifikovány imunofluorescencí. Například v obousměrné replikaci budou červené signály z prvního impulsu lemovány na každém konci zelenými signály z druhého impulsu. Dřívější zprávy pomocí SMARD dospěla k závěru, že většina replikace zahajuje na subtelomeric regionů v myšího a lidského genomu, a jen zřídka v telomery sami (Sfeir et al., 2009; Drosopoulos a kol., 2012). V nedávné studii drosopoulos et al. (2015), fluorescenční in situ hybridizace (FISH) s použitím sond z telomer regionu povolena replikace vzor, které mají být analyzovány za 320 kb genomické segmentu od konce myší chromozom ruku 14q. Vzhledem k dlouhé době (4 h) pro první (červená), puls, obvykle pouze červené plochy signálu v telomer byly pozorovány, ale vzhledem k tomu, mnoho těchto molekul neměl červený signál rozšířit do subtelomeric regionu, to může být pohodlně k závěru, že musí mít replikace zahájena v telomer (Obr. 1 B). Navíc, některé molekuly měly červený signál v telomere lemovaný zeleným signálem, podporující tento závěr. Ačkoli v těchto případech byl chromozom-proximální zelený signál, chromozom-distální zelený signál byl zřídka pozorován. Tak, ačkoli tam bylo málo důkazů pro obousměrnou replikaci pocházející z telomer, to je velmi jasné, že replikace původu, mohou existovat v rámci telomer správné se replikační vidlice, která se rozprostírá čas do subtelomere. Je třeba prošetřit, zda replikace zahajuje na relativně vysoké frekvenci v telomery chromozomů, jiné než 14q.
Tato zjištění vyvolávají otázku, zda počátek pro replikaci DNA se shoduje s jednoduchou sekvenci opakujte nalézt v telomery, nebo místo, pokud se to shoduje s některými dalšími sekvence, které by mohly být rozptýleny ve telomer. Bývalý je navrhl studii s Xenopus mobil-zdarma výtažky, které by mohly sestavit pre-replikační komplex a podstoupit DNA replikace na exogenní DNA obsahující výhradně telomerické opakuje (Kurth a Gautier, 2010). Podobné závěry, že replikace DNA může iniciovat v jednoduchém DNA opakuje nalézt v centromery, kde replikace bubliny byly pozorovány u Drosophila virilis pomocí elektronové mikroskopie bylo dosaženo (Zakiana, 1976), a nedávná studie naznačuje, že DNA replikace zahajuje v lidské alfa-satelitní DNA (Erliandri et al., 2014).
replikační vidlice se pomalu pohybují telomerní DNA (Ivessa et al ., 2002; Makovets et al., 2004; Miller a kol., 2006; Sfeir et al., 2009) vzhledem k vysoké tepelné stability GC-bohaté telomerické DNA, stejně jako jeho sklon tvořit stabilní sekundární struktury, jako je G-quadruplex (G4) DNA, což může představovat problém pro replikaci DNA (Lopes et al., 2011; Paeschke a kol., 2011). Různé helikázy pomáhají vyřešit tento problém; například pif1 helicase pomáhá uvolnit G4 (Paeschke et al ., 2013). Bloom syndrom helicase (BLM) a Werner syndrom helicase (WRN) jsou rovněž zapojeny do pomoci replikace telomer: BLM potlačuje replikaci závislé křehké telomery (Sfeir et al., 2009) a WRN potlačuje defekty v syntéze zaostávajícího řetězce telomer (Crabbe et al., 2004). Drosopoulos et al. (2015) a teď zpráva, že přední pramen syntézu, která iniciuje v rámci telomer má pomalejší rychlost progrese do subtelomere v BLM-deficientní buňky jako zobrazeny pomocí SMARD. Navíc byla vyšší frekvence iniciace replikace v subtelomeru 14Q buněk s deficitem BLM, pocházejících blíže k telomere než v buňkách s deficitem BLM. Tato pozorování naznačují, že počátky spící replikace v subtelomeru 14q lze aktivovat, když je v buňkách s deficitem BLM bráněno progresi vidlice (obr. 1 C). Drosopoulos et al. (2015) také zjistili nárůst subtelomeric replikace zahájení, kdy replikační vidlice progrese od telomer bylo bráněno aphidicolin, jako alternativní prostředek k aktivaci spící počátky replikace stresu. Když byly buňky ošetřeny stabilizátorem G4 PhenDC3, 14Q subtelomerní původ se v buňkách s deficitem BLM dále zvýšil. Souhrnně údaje naznačují zpomalení progrese vedoucí strand synthesis od původu v 14q telomer (pomocí G-bohaté rodičovské pramen jako šablonu) až G4 struktury nemohou být vyřešeny v BLM-deficientní buňky. Jako další podpora role helikázy BLM při odstraňování struktur G4 došlo ke zvýšenému barvení buněk s deficitem BLM protilátkou BG4 (Biffi et al ., 2013) proti G4 v celém genomu a zejména v telomerech.
WRN helicase může uvolnit G4 in vitro (Fry a Loeb, 1999; Mohaghegh et al., 2001). Když Drosopoulos et al. (2015) používá SMARD analyzovat replikace v buňkách dvojnásob nedostatkem obou BLM a WRN, zjistili výrazné snížení počtu červených replikační signál v 14q telomery, což naznačuje, že některé funkční překrývání mezi BLM a WRN s ohledem na přední pramen syntéza z G-bohaté vlákno telomery. Na podporu tohoto závěru bylo více barvení G4 protilátkou BG4 v buňkách dvojnásobně deficientních jak BLM, tak WRN než v buňkách s nedostatkem jen BLM nebo jen WRN. Toto je první přímé demonstrace in vivo příspěvku BLM a WRN helicases v rozlišení G4 struktury, což je zvláště potřebné pro progresi přední pramen syntézu, která iniciuje v telomery a je zkopírován z G-bohaté vlákno.