Výhody a omezení microarray technologie v lidské rakoviny
V dubnu tohoto roku jsme byli svědky jednoho z nejvíce monumentální úspěchy v biologii: kompletní sekvenování lidského genomu. Dekódování a databázové ukládání miliard bází sekvence je výchozím bodem postsequence funkční genomiky. Objev periodické tabulky měl důležitý dopad na chemii. Také úplné dešifrování lidského genomu bude mít působivé účinky na lidské zdraví a kvalitu života. V současné době chápeme funkci pouze omezeného počtu lidských genů. Studovat všechny funkce lidských genů je technologická výzva. Aby bylo možné čelit této výzvě, byly vyvinuty nové vysoce výkonné nástroje. Na microarray testu je výkonný molekulární technologie, která umožňuje simultánní studii expresi tisíců genů nebo jejich RNA produkty, dávat přesný obraz genové exprese v buňce nebo vzorku v době studie.
například, exprese všech genů pro rezistence a metabolismu nebo všech známých onkogenů v buňce mohou být detekovány a měřené ve stejném časovém horizontu (Hnědá a Botstein, 1999; Collins, 1999; Lander, 1999). Microarray může být definován jako uspořádaná sbírka mikrospotů( sondy), každá skvrna obsahující jeden druh nukleové kyseliny a představující geny zájmu. Tato technologie je založena na hybridizaci mezi označeny zdarma cíle odvozené z biologického vzorku a množství různých DNA sond, které jsou imobilizovány na matice (Southern et al., 1999). Cíle jsou produkovány reverzní transkripcí a současným značením extraktů RNA z biologického vzorku hybridizovaného sondami fragmentů DNA. Hybridizační signál produkovaný na každé sondě je úroveň exprese mRNA odpovídajícího genu ve vzorku v době studie. Signály jsou detekovány, kvantifikovat, integrované a normalizovaný specializovaný software a odrážet ‚gene expression profile „nebo“ molekulární portrét‘ pro každý biologický vzorek.
mnoho tisíc nebo desetitisíce odlišných skvrn lze vytisknout na křemíkové nebo skleněné podložce nebo na nylonové pevné bázi. Existují hlavně dvě varianty mikroarrays: cDNA a oligonukleotidové mikroarrays (Schena et al., 1995, 1996; Lockhart a kol., 1996). Ačkoli se oba typy microarray používají k analýze vzorců genové exprese, tyto varianty se zásadně liší (Lipshutz et al., 1999). V mikroarrays cDNA jsou relativně dlouhé molekuly DNA imobilizovány na pevném povrchu. Tento typ microarray se většinou používá pro rozsáhlé screeningové a expresivní studie. Na oligonukleotidových microarrays je vyrobena in situ světlo-režie chemickou syntézou nebo konvenční syntézy následuje imobilizace na skleněné matrici. Tento microarray se používá pro detekci mutací, genové mapování a studie exprese a umožňuje pro diferenciální detekce genové rodiny nebo alternativní transkripty, které nejsou rozlišitelné pomocí cDNA microarrays.
chemie microarray sama o sobě není nová, protože hybridizační technologie byla po celá desetiletí dobře zavedena. Současné studium tisíců genů však transformuje techniku microarray na výkonný analytický nástroj celého systému. Od vytvoření prvních mikroarrays uplynulo téměř 10 let, a přesto se tato technologie stále zlepšuje a postupuje. Od svého počátečního zavedení se počet aplikací microarray rozšířil (Obrázek 1). Počínaje jejich použitím při screeningu genů a identifikaci cílů, tato technologie nalézá nové aplikace, jako je vývojová biologie, klasifikace nemocí, studie cest, objev léků a toxikologie. Technologie výroby a použití microarray je nad rámec této recenze, ale byl značně přezkoumána jinde (Schena et al., 1995; Niemeyer a Blohm, 1999; Bowtell, 1999; Brown a Botstein, 1999; Celis a kol., 2000; Cheung a kol., 1999; Duggan a kol., 1999; Graves, 1999; Khan et al., 1999; Hegde a kol., 2000; Meldrum, 2000). Popisujeme zde některé z posledních vývoje a výsledků v technologii microarray ve výzkumu rakoviny, diskutovat o potenciálních problémech, popsat klinické aplikace a komentovat budoucnost této technologie.
Počet citací nalezených v MEDLINE vložením ‚microarray‘ (šedý pruh) nebo ‚microarray+rakovině (bílý pruh) na PubMed search. Články byly publikovány mezi roky 1995 a 2002
důležitost měření globální genové exprese v lidských nádorech
Charakterizující obyvatelstvo z transkribovaných genů vedla k vytvoření nového termínu, transcriptome (Su et al., 2002). Tento koncept definuje kompletní sadu transkribovaných genů exprimovaných jako messenger RNA pro určitý druh. Transkriptom tedy představuje vesmír poslů RNA, kteří mohou kódovat proteiny. Pouze přibližně 5% genů je aktivních v určité buňce v daném časovém okamžiku. Většina genů je potlačena a tato kontrola může nastat buď na transkripční nebo translační úrovni. Protože regulace exprese proteinu na úrovni transkripce je účinnější, většina kontroly probíhá na této úrovni. Profil genové exprese buňky určuje její funkci, fenotyp a reakci na vnější podněty. Profily genové exprese proto mohou pomoci objasnit buněčné funkce, biochemické cesty a regulační mechanismy. Kromě toho, profily genové exprese nemocných buněk/tkání, ve srovnání s normální ovládací prvky, může podporovat porozumění patologii onemocnění, a identifikovat nové terapeutické body zásahu, zlepšení diagnózy a upřesnění prognózy.
během posledních několika let se objevilo několik metod profilování genové exprese, které byly úspěšně aplikovány na výzkum rakoviny. Patří mezi ně diferenciální zobrazení, sériová analýza genové exprese a mikroarrays (Velculescu et al., 1995; Granjeaud a kol., 1999; Cheng et al., 2002). Mikroarrays se staly důležitými, protože se snadněji používají, nevyžadují rozsáhlé sekvenování DNA a umožňují paralelní kvantifikaci tisíců genů z více vzorků. Genová exprese profilování rakoviny představuje největší kategorii výzkumu pomocí technologie microarray a zdá se, že je nejkomplexnějším přístupem k charakterizaci rakoviny molekulárně. Ačkoli je rakovinový fenotyp určen pouze částečně jeho transkriptomem, stále poskytuje jasný obraz fyziologického stavu buňky. Sílu tohoto přístupu byla prokázána ve studiích prováděných na rozsáhlou řadu malignit, včetně rakoviny prsu, hlavy a krku, jater, plic, vaječníků, slinivky břišní, prostaty a žaludku (Bhattacharjee et al., 2001; Dhanasekaran et al., 2001; Garber et al., 2001; Tonin et al., 2001; Al Moustafa et al., 2002; Belbin et al., 2002; Chen a kol., 2002; Han et al., 2002; Hedenfalk et al., 2002; Hroch a kol., 2002; Luo a kol., 2002a).
Několik studií rakoviny profilování pomocí microarray analýzy používají různé strategie, jako je nádor ve srovnání s kontrolou, ve které je nádor profilu genové exprese je ve srovnání s odpovídající kontrolní vzorek pro měření rozdíly a podobnosti mezi oběma fenotypy, rakovina stratifikace, ve které expresních profilů z různých vzorků stejného typu rakoviny jsou ve srovnání odhalit odlišné podskupiny lépe definovat molekulární klasifikace společného histologický typ rakoviny, a konečně časové hodnocení nádoru, ve kterém genu vzorce exprese ze vzorků nádorů odvozených z různých stádií progrese jsou porovnávány s cílem objasnit rozdíly mezi časným a pokročilým stádiem onemocnění. Přestože bylo publikováno mnoho studií microarray analýzy u lidských nemocí, představujeme zde některé z těch, kteří mají klinický zájem o onkologii.
Microarray a rakovina prostaty
nedávno bylo publikováno několik studií využívajících microarrays k charakterizaci profilů genové exprese rakoviny prostaty. Tyto studie použily technologii microarray jako nástroj pro objevování genů k identifikaci genetických markerů, které rozlišují mezi normálními a rakovinnými tkáněmi prostaty. Byla provedena jednoduchá studie microarray pomocí skvrnitých membránových polí k analýze normálních a rakovinných tkání a buněčných linií (Bull et al ., 2001). Membrána microarray nálezy jsou omezeny relativní necitlivost této techniky k detekci přepisy vyjádřené na nízké úrovni, a malý počet míst, které mohou být umístěny na membrány; tato studie však přinesla kandidátní markery rakoviny prostaty pro další hodnocení. Pět publikovaných studií analyzovali profily genové exprese několika tisíc genů v normální a prostaty tkáně a používá se bez dozoru hierarchické shlukování analýza třídit vzorky (Dhanasekaran et al., 2001; Luo et al., 2001, 2002b; Welsh et al., 2001a; Singh a kol., 2002). Dhanasekaran et al. (2001) byli schopni odlišit normální prostaty, benigní hyperplazie prostaty (BPH), lokalizované rakoviny prostaty a karcinomem prostaty vzorky pomocí 9,984 prvek-skvrnitý microarrays. Pomocí hierarchické shlukovací analýzy, Luo et al. (2001) byli schopni rozlišit 16 vzorků rakoviny prostaty z devíti vzorků BPH na základě rozdílů v profilech genové exprese měřených na mikroarraysech cDNA s prvky 6,500. Welsh et al. (2001a) hlásil podobné třídění normálních a maligních vzorků tkáně prostaty pomocí oligonukleotidových mikroarrays. Zajímavé je, že všech pět skupin identifikovaných transmembránové serin proteázy hepsin jako zobrazení výrazně zvýšená exprese v maligní tkáně ve srovnání s normální prostatické tkáně (Dhanasekaran et al., 2001; Luo et al., 2001, 2002b; Welsh et al., 2001a; Singh a kol., 2002). Mnoho dalších kandidátských markery rakoviny prostaty jako proto-onkogenu PIM1 se objevily z jiných studií a jsou dále zkoumány jako potenciální diagnostické markery. Snížená exprese PIM1 na imunohistochemii vzorků nádoru prostaty přinesla zvýšené riziko recidivy po operaci (Dhanasekaran et al ., 2001). Jiné skupiny používající kombinace subtraktivní hybridizace a microarray analýzy identifikovaly několik potenciálních kandidátů na imunomodulační terapii rakoviny prostaty, včetně prosteina (Xu et al ., 2001), STEAP (Hubert et al., 1999) a p504S / alfa-Methylacyl-CoA-Racemáza (Jiang et al., 2001). Ve velmi nedávné studii, Virolle et al. (2003) použili buněčné linie rakoviny prostaty, která vyjadřuje vysokou konstitutivní hladinu Egr1 protein, transkripční faktor, nadměrně exprimován ve většině agresivní tumorigenní buňky rakoviny prostaty. Hodnotí Egr1 transkripční regulace, provedením oligonukleotidových microarrays analýza pomocí buněk poskytnuté nedostatkem Egr1 jako srovnávací vzorek pro identifikaci Egr1 cílové geny. Poprvé v prostaty tkáně, tato studie potvrdila růst-enhancer roli Egr1 dříve pozorovány u dalších buněčných systémů, a identifikoval několik nových cílových genů, konkrétně kontrolující růst, progresi buněčného cyklu a apoptotických drah.
Microarray a orální rakovina
dosud bylo publikováno pouze několik studií microarray relevantních pro orální rakovinu. Chang et al. (1998) ilustroval použití mikroarrays cDNA k charakterizaci genů souvisejících s transformací u rakoviny ústní dutiny. Villaret et al. použita kombinace komplementární DNA odčítání a microarray analýzy zhodnotit jedinečné geny specifické pro spinocelulární karcinom hlavy a krku (HNSCC) jako potenciální nádorové markery a kandidátských vakcín. Bylo zjištěno, že devět známých genů je významně nadměrně exprimováno v HNSCC ve srovnání s normální tkání. Kromě toho byly v podskupině nádorů nadměrně exprimovány čtyři nové geny (Villaret et al ., 2000). Alevizos et al. (2001) analyzoval transkriptom v spinocelulárním karcinomu ústní dutiny. Našli asi 600 kandidátních genů (onkogeny, nádorové supresory, transkripční faktory, diferenciace značky, metastatické cizorodých bílkovin a enzymů), které byly rozdílně vyjádřené v rakovinu ústní dutiny, ověřování pouze tři z těchto genů pomocí PCR.
Lu et al. (2001) použil microarray přístup k vyhodnocení změn profilu genové exprese během iniciace a progrese spinocelulárního karcinomu jícnu. Zkoumali profily genové exprese v různých fázích iniciace a progrese rakoviny jícnu s cílem identifikovat geny rozdílně vyjádřené mezi tyto fáze. Frierson a kol. (2002) použili oligonukleotid analýza microarray pro studium exprese 8,920 různých lidských genů v 15 adenoidně cystické karcinomy (ACCs), jeden ACC buněčné linie a pět normálních velkých slinných žláz. Mezi geny se změněnou expresí v ACC byly ty, kódující transkripční faktory SOX4 a AP-2 gama, kasein kinázy 1, stejně jako epsilon a frizzled-7, z nichž oba jsou členy Wnt/beta-catenin signální dráhy. Ve velmi nedávné studii, Leethanakul et al. (2003) generované knihovny cDNA s vysokou složitostí z mikrodisekce laserem normální a rakovinný dlaždicový epitel. V této studii autoři průzkumu k dispozici informace o posloupnosti pomocí bioinformatická nástroje a identifikovat 168 nových genů rozdílně vyjádřené v normálních a maligních epitelu. Navíc pomocí polí cDNA získali důkaz, že podmnožina těchto nových genů může být vysoce exprimována v HNSCC.
Microarray a rakovina prsu
vzhledem k klinické heterogenitě rakoviny prsu může být technologie microarray ideálním nástrojem pro stanovení přesnější klasifikace. Počáteční studie pomocí microarray-based výraz profilování prokázala svou schopnost správně klasifikovat estrogen receptor-negativním a estrogen receptor-pozitivní rakoviny prsu (Perou et al., 2000; West a kol., 2001) a odlišit nádory související s BRCA1 od nádorů souvisejících s BRCA2 a sporadických nádorů (Hedenfalk et al ., 2001; van ‚ t Veer et al., 2002).
studie van ‚ t Veer et al. byla jednou z nejrozsáhlejších a nejinformativnějších studií provedených dosud. Autoři vyšetřili 117 prsu primární vzorky pomocí microarray-based profilování genové exprese rozvíjet prognostické profily a porovnat tyto známé prognostické markery u karcinomu prsu. Z 5 000 genů s variabilními expresními profily bylo 70 identifikováno pro optimální přesnost při předpovídání recidivujícího onemocnění. Pomocí této klasifikace autoři správně předpověděli skutečný výsledek onemocnění u 65 ze 78 pacientů. Pět pacientů s dobrou prognózou a osm pacientů se špatnou prognózou bylo nesprávně přiděleno. Standardní prognostické markery u karcinomu prsu byly použity k odhadu rizika recidivy rakoviny a pomoci při rozhodování o adjuvantní terapii. Bohužel současné prognostické markery dostatečně neidentifikují nejpravděpodobnější terapii pro pacienta. Prediktivní síla přístupu microarray je mnohem větší než u aktuálně používaných přístupů, ale musí být validována ve více prospektivních klinických studiích. Pokud by byla potvrzena prognostická hodnota tohoto přístupu, klasifikátor profilování exprese by vedl k přibližně čtyřnásobnému poklesu u pacientů, kteří zbytečně dostávají adjuvantní terapii (Caldas a Aparicio, 2002).
Martin et al. (2001) popsal metodu identifikace cirkulujícího karcinomu prsu dvoustupňovým procesem diferenciálního zobrazení a profilování exprese založené na vysoce citlivém poli. I když je potenciál této techniky slibný, je třeba ještě zlepšit její citlivost a specificitu a je zapotřebí více práce k určení klinického významu detekce profilu genové exprese v periferní krvi. Některé články nyní prokázaly souvislost mezi profily exprese nádoru pomocí technologie microarray a klinickým výsledkem. Například Sorlie a kol. (2001) prokázal, že podtřídy nádorů definované profilováním exprese mohou předpovídat bez onemocnění a celkové přežití, a Sotiriou et al. (2002) ukázal, že předčištění výraz profily předpokládané klinické odpovědi na chemoterapii v malém vzorku nádorů prsu. Ačkoli studie Sorlie et al. byl velmi provokativní, autoři nesrovnával prognostické hodnoty skupiny identifikovány pomocí hierarchického shlukování se v současné době používají prognostické faktory u karcinomu prsu. Od lékové rezistence v prsu je hlavní překážkou k úspěšné chemoterapie, proveditelnost získání potenciální molekulární profil nebo otisků prstů protinádorových léčiv do nádorových buněk pomocí microarray technologie je důležité předvídat chemoterapie reakci. Kudoh a kol. (2000) prokázala tuto schopnost definovat změny v profilech genové exprese v buněčné linii rakoviny prsu léčené chemoterapií. Sledovali expresivní profily buněk karcinomu prsu MCF-7, které byly buď přechodně léčeny doxorubicinem, nebo byly vybrány pro rezistenci na doxorubicin. Tato studie ukázala, že přechodná léčba doxorubicinem změnila expresi rozmanité skupiny genů časově závislým způsobem.
Microarray a rakoviny vaječníků
v posledních několika letech, několik vyšetřovatelé zveřejnili zajímavé studie týkající se výraz profilování rakoviny vaječníků. Martoglio et al. (2000) analyzoval profily genové exprese pěti normálních vaječníků a čtyř špatně diferencovaných vzorků serózního papilárního ovariálního adenokarcinomu. Pomocí malého „in-house“ nylon membrána cDNA microarray, našli celkovému zvýšení angiogeneze související s markery (např. angiopoietin-1, VEGF), apoptotických a nádorových markerů, imunitní reakce mediátory a nové potenciální markery ovariálního karcinomu (např. cofilin, moesin a neuron-restriktivní tlumič protein faktoru) v nádorové tkáni. Studie byla zajímavá, protože použili nízkonákladové cDNA pole přizpůsobené pro studium specifických cest, jako je angiogeneze a tumorigeneze. Protože to je problematické pro přístup k adekvátní množství předčasné ovariální nádorové tkáně, vědci používají různé strategie, jak obejít potřebu tkáně částky obvykle vyžadované microarray analýzy. Například Ismail et al. (2000) uvádí studii 864 DNA prvky chráněny před 10 vaječníků rakovinné buňky, řádky a pěti normálních epiteliálních buněčných linií pomocí krátkodobé buněčné kultury rozšířit ovariální povrchový epitel před RNA extrakce. Jiní vyšetřovatelé purifikovali ovariální epitel in vitro postupy, jako je adherence ke sklu nebo imunomagnetické obohacení (Ono et al., 2000; Welsh et al., 2001b). Tyto dva přístupy však mohou zavádět předsudky v pozorované genové expresi. Ve skutečnosti první přístup (Ismail et al., 2000) používá Kultivované rakovinné buňky, které nemusí odrážet rakoviny in vivo kvůli možnosti sekundárních změn genové exprese, ke kterým dochází in vitro v důsledku kultivačních podmínek. Druhá strategie (Ono et al., 2000; Welsh et al., 2001b) je velmi dlouhý a může vést k degradaci méně stabilních RNA poslů. Aby se zabránilo možným předsudkům in vitro kulturám používaným v některých studiích (Ismail et al ., 2000; Matei a kol., 2002), další vyšetřovatelé studovali vzorce genové exprese přímo z chirurgicky resekovaných nádorů (Shridhar et al ., 2001). Malé, specializované microarrays mají několik praktických výhod a mohou odhalit informace, které mohou být ztraceny ve větších microarrays. Sawiris et al. (2002) používá vysoce specializované cDNA microarray s názvem ‚Ovachip‘, a našel tohle microarray extrémně citlivý na rozlišování rakoviny vaječníků, rakoviny tlustého střeva na základě genové exprese vzory. Screening biomarkery pro rakovinu vaječníků jsou velmi důležité, protože pozdní fázi při diagnóze a špatné přežití spojené s tímto typem rakoviny. V poslední době, dvě studie, které microarray technologie k identifikaci dvou nadměrně exprimován potenciální rakoviny vaječníků sérových markerů, tzv. osteopontin a prostasin, a uvádí předběžné ověření jejich použití pro včasnou detekci onemocnění (Mok et al., 2001; Kim et al., 2002).
Microarray a další rakoviny
aplikace technologie microarray na jiné lidské rakoviny se rychle rozšiřuje. Průkopnická studie Golub et al. (1999) prokázala možnost odlišit akutní myeloidní leukémie a akutní lymfoblastické leukémie (ALL) na základě genové exprese sledování a jak, v simulované situaci ‚slepý‘ na histologické diagnóze, dvě třídy mohl být objeven genové exprese vzory sami. Alizadeh et al. (2000) identifikoval dvě formy difúzního velkého B-buněčného lymfomu (DLBCL) na základě profilů genové exprese, které svědčí o různých stádiích diferenciace B-buněk. Je zajímavé, že tato molekulární klasifikace má prognostickou hodnotu nezávislou na stratifikaci obvyklým klinickým klasifikací. Pro studium genové exprese u lymfoidních malignit, velké společné skupiny vytvořené specializované microarray, s názvem ‚Lymphochip‘, který je obohacen geny, které jsou selektivně vyjádřené v lymfocytech a v genech regulujících funkci lymfocytů (Alizadeh et al., 1999). Tato skupina použila tento mikroarray ke zkoumání DLBCL a našla dvě molekulárně odlišné formy tohoto nádoru. Dále prokázali, že podskupiny DLBCL definovaly podskupinu pacientů s odlišnou klinickou prognózou. Testovat hypotézu, že B-buněčná chronická lymfocytární leukémie (CLL)je více než jedno onemocnění, Rosenwald et al. (2001) souvisely vzorce genové exprese CLL s jejich mutačním stavem Ig a s jinými typy normálních a maligních B buněk. Zajímavé je, že geny identifikovány jako vysoce exprimován v CLL ve srovnání s DLBCL bylo vyjádřeno ekvivalentně ve všech CLL vzorky bez ohledu na jejich Ig mutační status. Tato studie naznačila, že všechny případy CLL sdílely společný mechanismus transformace a / nebo buňky původu. Nedávná studie (Stratowa et al., 2001) navrhl seznam potenciálních nových prognostických markerů zapojených do obchodování s lymfocyty a spojených s stagingem onemocnění a / nebo přežitím pacienta.
ve velmi nedávné studii Gariboldi et al. (2003) analyzovali profily genové exprese v normální tkáni nádoru kůže-citlivé a rezistentní myši s cílem identifikovat geny, které hrají funkční roli v genetické náchylnosti. Tato studie navrhla roli Scca2 gene, člen serin proteázy nadčeleď, v genetické predispozice k kožní nádory.
technologie Microarray byla také použita při analýze melanomu (Bittner et al ., 2000). Tato studie naznačila, že expresních profilů v rámci jednotlivých tkání pacienta může být pozoruhodně zachovány v průběhu času, a že globální přepis analýza může identifikovat neznámé subtypy kožního melanomu a předvídat experimentálně ověřitelné phenotypical vlastnosti.
studie na buňkách a tkáních rakoviny tlustého střeva prokázaly významnou supresi genu kinázy, WEE1Hu (Backert et al ., 1999).
mnoho transkriptomů se mění po specifické nadměrné expresi genů souvisejících s nádorem. Například jsme využili adenovirem zprostředkovaný výraz systém s příponou rb2/p130 tumor-supresorového genu v non-malá buňka rakovina plic-line s cílem identifikovat konkrétní geny, které jsou regulovány pRb2/p130 (Russo et al., 2003). Naše výsledky microarray identifikovali řadu genů, zapojených do mnoha buněčných procesů včetně buněčného dělení, buněčná signalizace/buněčné komunikace, buněčné struktury/pohyblivost a genové exprese a metabolismu. Tyto výsledky naznačují nové potenciální terapeutické biomarkery u karcinomu plic. Kromě toho výsledky další studie cDNA microarray naznačují, že nadměrná exprese tumor-supresorového genu PTEN může inhibovat invazi rakoviny plic downregulací panelu genů (Hong et al ., 2000). Ve světle výše uvedených údajů je zřejmé, že přístup microarray je velmi důležitý při analýze různých typů nádorů.