Le chlorure de lithium tue efficacement le Varroa destructeur parasite des abeilles mellifères par un mode d’action systémique

Étude pilote : De l’ARNi au chlorure de lithium

Dans une étude pilote, des abeilles mellifères infestées d’acariens ont été mises en cage et nourries à du sirop de saccharose contenant des ARND de gènes Varroa potentiellement essentiels (Tableau supplémentaire S1). Le sirop de saccharose ordinaire (non traité) et le sirop contenant de l’ARNDSR basé sur la séquence codante de la protéine fluorescente verte GFP (dsGFP ctrl) ont servi de témoins. La GFP est exprimée chez la méduse hydrozoaire bioluminescente Aequorea victoria. La séquence GFP a été choisie comme témoin car aucun gène homologue n’existe dans le génome des abeilles mellifères ou de l’acarien Varroa. Dans le groupe non traité, la mortalité par acariens était de < 5%. En revanche, tous les acariens des abeilles qui ont reçu une solution de saccharose contenant de l’arNSR ciblant les gènes Varroa ont été effectivement tués en trois jours. Un effet identique sur les acariens a cependant été observé dans une expérience témoin dans laquelle des abeilles ont été nourries à l’ARN DSRN GFP (Fig. S1). Ces résultats ont exclu le mécanisme médié par l’ARNi proposé, mais ont suggéré soit un effet encore inconnu de l’ARN, soit l’activité d’autres composants dans la solution d’essai. Étant donné que des concentrations élevées de chlorure de lithium (LiCl) ont été utilisées dans la production de DSRNA et donc nourries aux abeilles avec le dsRNA, nous avons choisi de nourrir LiCl en solution de saccharose aux abeilles en cage pour tester son activité contre les acariens Varroa. De manière frappante, LiCl à des concentrations de 25 mM, ce qui correspond à la concentration calculée dans la solution d’ARND, a tué les acariens aussi efficacement que les substances testées contenant de l’ARND. De plus, après que LiCl a été largement éliminé de l’ARNDRS par un lavage extensif (ctrl dsGFP lavée), l’activité acaricide a été considérablement diminuée, comme indiqué par un début retardé et une activité réduite (Fig. supplémentaire. S1). À partir de ces données, nous avons conclu que le LiCl, et non le knockdown de l’ARN, était la médiation de l’activité observée sur les acariens Varroa et qu’il serait intéressant d’analyser le potentiel du LiCl en tant que varroacide.

Concentration effective de chlorure de lithium

Pour corroborer les principales observations de notre étude pilote, nous avons établi des expériences en cage avec différentes concentrations de LiCl pour une analyse statistique robuste. En plus de la concentration de 25 mM, qui s’est avérée efficace dans l’étude pilote, nous avons utilisé des concentrations de 2 mM, 4 mM et 10 mM afin de déterminer le seuil d’efficacité inférieur. Les résultats corroborent les conclusions de l’étude précédente et ont démontré des effets acaricides significatifs pour des concentrations de LiCl aussi faibles que 2 mM à partir desquelles une augmentation substantielle de la mortalité par acariens (P < 0,001, test de rang log; Tableau supplémentaire S2) a été démontrée. Des concentrations plus élevées de 10 mM et 25 mM ont toutes deux considérablement augmenté la mortalité des acariens à partir du deuxième jour du traitement et ont permis d’exterminer plus de 96% des acariens traités à la fin de l’expérience (Fig. 1a, Tableau supplémentaire S2). Dans les expériences témoins sans LiCl dans la solution d’alimentation, la mortalité des acariens atteignait en moyenne 9,3% et se situait donc bien dans la fourchette des taux de mortalité obtenus pour les acariens gardés sur des abeilles en cage non traitées dans différentes conditions ambiantes33. Sur la base de ces résultats, nous avons confirmé un effet clair de LiCl sur la viabilité des acariens dans une plage de concentration comprise entre 2 mM et 25 mM.

Mortalité des phorétiques Acariens du varroa et abeilles mellifères après avoir nourri le chlorure de lithium (LiCl) aux abeilles en cage. (a) courbe de survie de Kaplan-Meier des Varroas femelles gardées sur des abeilles en cage nourries avec LiCl à des concentrations comprises entre 2 mM et 25 mm (n = 33, 9, 9, 12 et 9 cages pour 0 mm (témoin), 2 mM, 4 mM, 10 mM et 25 mm, respectivement). À toutes les concentrations, la survie des acariens dans les groupes traités était significativement différente de celle du témoin (P< 0,001, test de rang log avec correction de Bonferroni). (b) courbe de survie de Kaplan-Meier des abeilles ouvrières en cage et des acariens Varroa femelles après 24 h d’exposition au LiCl (n = 9 cages). La survie des acariens dans le groupe traité était significativement différente de celle du groupe témoin (P< 0,001, test log-rank), mais il n’y avait pas de différences significatives entre les groupes dans la mortalité des abeilles.

Dans ces expériences, les abeilles en cage ont été nourries avec la concentration respective de LiCl pendant plusieurs jours jusqu’à ce que tous les acariens soient tués par le traitement. Cependant, pour une utilisation potentielle dans la pratique apicole, une période de traitement plus courte et définie serait préférable. Nous avons donc effectué une expérience supplémentaire, dans laquelle la concentration la plus efficace de 25 mm LiCl (Fig. 1a) a été administré pendant 24 h, suivi d’une alimentation avec une solution de sucre pendant six jours supplémentaires. À la fin de la période d’observation, 92.9% des acariens (n = 225 acariens, P< 0,001, test de rang log) ont été tués sans effet significatif sur les abeilles traitées (voir paragraphe suivant). Ce résultat démontre clairement que même une alimentation à court terme de 25 mm LiCl est suffisante pour diminuer considérablement la population d’acariens.

Pour déterminer avec précision la quantité de LiCl ingérée par les abeilles qui est nécessaire pour tuer les acariens parasitaires, 12 abeilles nouvellement écloses ont été nourries artificiellement 10 µl de solutions de LiCl de 4 mM à 100 mM et conservées individuellement avec un acarien phorétique pendant cinq jours dans des cages. Avec les solutions de 4 mM et 10 mm, qui correspondaient à une absorption de 1,7 µg et 4,2 µg de LiCl, respectivement, l’effet n’était pas significativement différent du témoin non traité (n = 12 acariens, P = 1.000, test log-rank, Tableau supplémentaire S3). Cependant, une dose unique de 25 mM, correspondant à 10,6 µg de LiCl consommée par l’abeille a suffi à tuer 100% des acariens phorétiques en 48 heures (Fig. 2).

Mortalité des varroas phorétiques gardés sur des abeilles qui ont été nourries individuellement de 10 µl d’une solution de chlorure de lithium à des concentrations allant de 4 mM à 100 mM. Les abeilles ont été nourries LiCl une seule fois au début de l’expérience, puis elles ont reçu du sirop de saccharose pendant cinq jours. Pour chaque concentration, 12 cages contenant chacune une abeille et un acarien Varroa ont été analysées. La survie des acariens a été significativement réduite par rapport au groupe témoin lorsque des concentrations de 25 mM et plus ont été données aux abeilles (P< 0,001, test de rang log).

Effet sur les abeilles ouvrières

Pour l’analyse de la tolérabilité du LiCl aux abeilles ouvrières, les cages d’essai utilisées pour analyser la mortalité par acariens (Fig. 1a) ont également été enregistrées pour la mortalité des abeilles ouvrières. Après exposition à des LiCl de 2 mM, 10 mM et 25 mM qui ont montré une activité acaricide, la mortalité des abeilles ouvrières traitées variait en moyenne de 3 à 7% dans les différents groupes d’alimentation. À l’exception du groupe LiCl de 10 mM (n = 12 cages, P = 0,015, test de rang log; Tableau supplémentaire S4), les valeurs n’étaient pas significativement différentes de la mortalité de 4 % dans le groupe témoin non traité. De plus, les taux de mortalité de nos témoins se situaient bien dans la fourchette de mortalité des abeilles en cage non traitées requise comme témoin dans les tests toxicologiques34, confirmant ainsi la validité de notre système de test. De plus, le traitement de 24 h par LiCl n’a pas affecté la mortalité des abeilles ouvrières (Fig. 1b; n = 9 cages, P = 0,308, test de rang log). Une bonne tolérance de LiCl aux abeilles a également été confirmée par l’alimentation d’une dose unique (pour la mortalité par acariens, voir Fig. 2) qui n’ont pas entraîné d’augmentation significative de la mortalité des abeilles ouvrières (P = 1.000, test de rang log; Tableau supplémentaire S5).

Ensuite, différentes concentrations de LiCl ont été nourries en continu jusqu’à la mort de la dernière abeille en cage pour étudier la réponse à une exposition à long terme. Ici, le traitement a considérablement réduit la durée de vie moyenne des abeilles ouvrières fraîchement écloses de 26 jours dans les cages témoins non traitées à 23 et 22 jours pour 2 mm et 10 mm LiCl, respectivement (n = 60 abeilles, P = 0,024, test de rang log; Tableau supplémentaire S6). Chez les abeilles ayant reçu la concentration la plus élevée de 25 mm LiCl, la durée de vie a été considérablement réduite à 19 jours en moyenne (Fig. 3 bis).

Mortalité des abeilles mellifères après avoir nourri du chlorure de lithium aux abeilles en cage. (a) courbe de survie de Kaplan-Meier des abeilles ouvrières en cage lors d’une exposition chronique au LiCl. Les régimes LiCl à des concentrations de 2 mM, 10 mM et 25 mM ont été nourris ad libitum jusqu’à la mort de la dernière abeille (n = 6 cages de 10 abeilles chacune). La survie de tous les groupes traités était significativement différente de celle du contrôle du sirop de sucre (P< 0,01, test de rang log avec correction de Bonferroni). (b) courbe de survie de Kaplan-Meier des abeilles ouvrières en cage après une exposition LiCl de 24 h. Les régimes LiCl à des concentrations de 2 mM, 10 mm et 25 mM ont été nourris ad libitum pendant les 24 premières heures après l’éclosion, puis remplacés par du sirop de saccharose (n = 12 cages de 10 abeilles chacune). La survie de tous les groupes traités n’était pas significativement différente du contrôle du sirop de sucre (P> 0,1, test de rang log avec correction de Bonferroni).

Cependant, le LiCl ne semble nuire à la viabilité des abeilles que s’il est administré sur une période prolongée, comme l’indique une expérience supplémentaire dans laquelle le LiCl a été nourri pendant les 24 premières heures après l’éclosion et a ensuite été remplacé par du sirop de saccharose jusqu’à la mort de la dernière abeille en cage (Fig. 3b). Ici, la durée de vie moyenne des abeilles ouvrières fraîchement écloses variait de 22 jours (10 mM) à 24 jours (témoins) sans différences significatives entre les traitements (n = 120 abeilles par traitement, P ≥ 0,126, test de rang log; Tableau supplémentaire S7). Sur la base de ces données provenant d’abeilles en cage, nous concluons que même un traitement LiCl à court terme est suffisant pour éradiquer complètement l’infestation d’acariens Varroa avec peu ou pas d’impact sur la viabilité des abeilles ouvrières. Ces résultats obtenus dans des tests en cage dans des conditions contrôlées représentent une première étape réussie et prometteuse vers une nouvelle approche du traitement du Varroa. Cependant, l’efficacité et les effets secondaires doivent être confirmés dans des conditions de terrain.

Essais sur le terrain avec du chlorure de lithium dans des essaims artificiels

Pour approximer les conditions sur le terrain, nous avons testé des LiCl de 25 mm et 50 mm dans neuf essaims artificiels sans couvain composés d’une reine et d’environ 20 000 abeilles chacun. Ces concentrations ont été choisies sur la base d’expériences antérieures avec des abeilles en cage en utilisant la dose la plus élevée qui était encore tolérée par les abeilles dans des temps d’application courts (25 mM). Parce qu’une distribution uniforme du sirop de saccharose dans l’ensemble de l’essaim artificiel d’environ 20 000 abeilles aurait pu être difficile à atteindre, nous avons en outre testé une concentration de LiCl de 50 mM pour nous assurer que chaque abeille était exposée à des quantités suffisantes de lithium. En conséquence, les essaims ont été nourris ad libitum avec du sirop de saccharose contenant 25 mm de LiCl (n = 6) ou 50 mM (n = 3) pendant une période de trois jours, suivie d’une application topique de Perizin®. La Périzine®, qui contient l’organophosphate coumaphos comme principe actif, est un varroacide très efficace couramment utilisé comme traitement contrôleur35. La mortalité par acariens a été suivie sur une période de cinq jours. Avant le traitement témoin, 25 mm de LiCl tuaient environ 90 % des acariens présents dans les essaims artificiels (tableau 1). La solution concentrée plus élevée (50 mM) n’a cependant pas augmenté cet effet (test χ2, P = 0,953). Dans l’ensemble, l’efficacité était légèrement inférieure à celle des tests en cage. Une explication pourrait être que la distribution de LiCl au sein d’un groupe de milliers d’abeilles nécessite plus de temps jusqu’à ce que la dernière abeille individuelle consomme une dose suffisante pour tuer l’acarien parasitant respectif. Le temps d’alimentation nécessaire de ces énormes entités de 20 000 abeilles et plus doit être analysé dans d’autres expériences.

Efficacité d’autres composés du lithium et de sels non lithium

Pour confirmer que le lithium est le composant actif de l’effet sur les acariens du Varroa, nous avons testé une série de composés du lithium et comparé les effets acaricides avec des sels non lithium. Le citrate de lithium, un composé contenant trois ions lithium, le sulfate de lithium et le carbonate de lithium, qui contiennent deux ions lithium par rapport à un seul ion lithium dans LiCl, est particulièrement intéressant. Des composés supplémentaires contenant un ion lithium (lactate de lithium, acétate de lithium), mais une solubilité, une réactivité chimique et un prix différents ont été inclus pour analyser l’efficacité et la tolérabilité par rapport au LiCl. Dans des expériences en cage, tous les composés ont éliminé 100% des acariens à 25 mM en trois jours (citrate de lithium et acétate de lithium) à quatre jours (sulfate de lithium, lactate de lithium et carbonate de lithium). De plus, les solutions d’essai de 4 mM ont entièrement tué les acariens phorétiques en cinq jours (citrate de lithium, sulfate de lithium et acétate de lithium) à sept jours (lactate de lithium), à l’exception du carbonate de lithium (Tableau 2; Tableau supplémentaire S8).

La mortalité des abeilles ouvrières n’a pas augmenté de manière significative à l’une ou l’autre concentration par rapport aux abeilles témoins non traitées, sauf pour le sulfate de lithium de 25 mM et le lactate de lithium de 25 mM (Tableau supplémentaire S9). Avec ces expériences, nous avons pu confirmer que d’autres composés du lithium ont un potentiel similaire pour l’utilisation comme acaricide systémique. Cela pourrait accroître la flexibilité pour la conception éventuelle d’un produit vétérinaire. Compte tenu du prix, le chlorure de lithium et le citrate de lithium sont les composés les moins chers. Le sulfate de lithium est moins approprié en raison de la tolérance plus faible des abeilles et le carbonate de lithium en raison d’une solubilité relativement faible dans l’eau.

Pour étudier plus en détail l’efficacité dépendante de la concentration des composés de lithium, nous avons comparé LiCl au citrate de lithium (Li3C6H5O7), qui présentait la plus grande différence dans le nombre d’ions lithium par molécule, à cinq concentrations différentes dans une plage de 1 mM à 25 mM. Toutes les concentrations de citrate de lithium présentaient une activité acaricide significativement plus élevée par rapport au LiCl, mais il n’y avait aucune différence dans la mortalité des abeilles (Tableau 3, Tableaux supplémentaires S9 et S11). Par conséquent, le citrate de lithium pourrait représenter un ingrédient actif encore meilleur.

En tant que témoin sans lithium et pour exclure le chlorure comme agent actif, nous avons également testé les sels alcalins chlorure de sodium (NaCl) et chlorure de potassium (KCl) ainsi que le chlorure de magnésium (MgCl) à 25 mM. Nous n’avons pas observé d’effet varroacide pour NaCl ou KCl (n= 3 cages, P= 1.000, test log-rank, Tableau supplémentaire S12). Dans les tests avec MgCl, 100% des abeilles en cage sont mortes dans les cinq jours (P<0.001, log-rank test), et compte tenu de la diminution du nombre d’abeilles, l’expérience a été terminée avant que l’effet sur les acariens puisse être analysé. Sur la base de ces expériences, nous avons conclu que le lithium médie effectivement l’activité acaricide de manière dose-dépendante et que le citrate de lithium présente les propriétés les plus favorables de tous les composés testés jusqu’à présent.

Potentiel des composés du lithium en tant que nouveau varroacide

Nous avons montré que non pas les ARN double brin initialement supposés contre les gènes essentiels du Varroa, mais de manière surprenante les sels de lithium ont un fort effet acaricide sur les acariens du Varroa sur les abeilles en cage et dans les essaims artificiels. Ainsi, ces résultats montrent que les composés du lithium représentent une nouvelle classe d’agents acaricides avec un potentiel exceptionnel et une tolérance remarquablement bonne pour les abeilles. La sensibilité différente des acariens et des abeilles au LiCl est d’autant plus remarquable qu’en raison des effets de dilution, la concentration de LiCl dans l’hémolymphe des abeilles sera probablement sensiblement inférieure à la concentration administrée aux abeilles.

Il est important de noter que nos résultats n’impliquent pas que les effets acaricides des approches basées sur l’ARNi telles que publiées par Garbian et al.32 sont généralement médiées par LiCl. Après l’alimentation d’un mélange de dsRNA aux abeilles mellifères sur une période de 60 jours, Garbian et al.32 ont enregistré une lente augmentation de la mortalité par acariens avec une efficacité finale du traitement de seulement 60%. Compte tenu de la réponse rapide et très efficace de nos essaims artificiels aux traitements par LiCl, différents modes d’action sont probables: alors que les effets médiés par l’ARNi semblent exercer des effets à long terme, les composés du lithium représentent un mécanisme indépendant avec un début rapide et une efficacité élevée.

En tant que varroacide, LiCl présente certaines caractéristiques uniques dans cette combinaison: (i) Le LiCl agit de manière systémique par l’intermédiaire de l’alimentation des abeilles mellifères (« facile à appliquer”), (ii) il est soluble dans l’eau et ne s’accumulera donc pas dans la cire d’abeille, ce qui est un problème crucial pour les concepts de traitement à long terme utilisant des varroacides synthétiques à propriétés lipophiles 36,37 (iii) la toxicité orale de la plupart des composés du lithium pour les mammifères est relativement faible38 (iv) il n’a aucun effet répulsif sur la solution d’alimentation dans la plage de concentration pertinente de 2 à 25 mM39 et (v) il est disponible à des prix modérés. Très prometteur est le fait qu’une seule application de seulement 10 µl de LiCl dans une solution de 25 mM (correspondant à une dose de 10,6 µg de LiCl) par abeille individuelle suffit à tuer les acariens phorétiques. Un défi pour d’autres recherches sera le développement d’une technique d’application intelligente pour les essaims et les colonies de taille réelle afin de s’assurer que toutes les abeilles reçoivent la quantité critique du composé actif.

Actuellement, nous ne savons pas comment LiCl tue les acariens phorétiques du Varroa, et il existe peu de publications sur l’effet du LiCl chez les insectes40. En médecine humaine, le lithium est utilisé depuis les années 1870 et est un agent stabilisant de l’humeur indiqué pour le traitement des épisodes maniaques et comme traitement d’entretien du trouble bipolaire41. Compte tenu de leur utilisation thérapeutique, les composés du lithium et leur profil de toxicité ont été soigneusement étudiés. Jusqu’à présent, un certain nombre d’enzymes agissant sur le métabolisme, le développement, l’hématopoïèse et d’autres processus ont été proposés comme cibles potentielles42,43. Ces enzymes nécessitent des ions métalliques et le lithium exerce son activité de manière non compétitive, ce qui se produit très probablement en déplaçant un cation divalent. Certes, nous n’avons actuellement aucune indication que l’effet acaricide observé des composés du lithium repose sur un mode d’action comparable.

Nous sommes également conscients du fait que nos résultats ne représentent que la première étape vers le développement d’un nouveau produit vétérinaire. Les essais sur le terrain dans des colonies en vol libre sont tout aussi nécessaires que l’analyse des effets secondaires sublétaux et à long terme sur les abeilles adultes et les couvées d’abeilles mellifères et des problèmes éventuels de résidus dans le miel.

Cependant, les résultats présentés ici indiquent déjà que le LiCl a un potentiel de traitement efficace et facile à appliquer pour les essaims artificiels et naturels et en particulier pour le grand nombre d’abeilles en paquets utilisées pour la pollinisation aux États-Unis11,44. En outre, l’élucidation du mécanisme d’action pourrait ouvrir de nouvelles voies pour le développement ciblé de produits vétérinaires pour lutter contre les acariens Varroa.