Suivi précoce du traitement de la tuberculose par Xpert® MTB/RIF

Aux éditeurs :

Les progrès réalisés pour améliorer les capacités de diagnostic de la tuberculose en laboratoire ont conduit au développement d’essais moléculaires qui remplacent désormais à grande échelle la microscopie conventionnelle et les méthodes basées sur la culture. Malheureusement, les techniques moléculaires actuelles détectent à la fois les bactéries vivantes et mortes, et un résultat positif n’implique pas la viabilité de l’agent pathogène. En effet, l’ADN peut persister pendant une longue période après la mort bactérienne et l’acide nucléique provenant de bactéries mortes est également amplifiable. Par conséquent, les dosages moléculaires ne conviennent pas à la surveillance du traitement et /ou au contrôle des infections.

Nous rapportons une approche innovante pour amplifier sélectivement l’ADN dérivé de Mycobacterium tuberculosis viable dans des échantillons cliniques, ce qui est utile pour surveiller la charge mycobactérienne chez les patients atteints de tuberculose pulmonaire pendant le traitement antituberculeux.

Le protocole est basé sur le prétraitement d’échantillons avec du monoazide de propidium (PMA; Biotium Inc., Hayward, CA, USA), un composé chimique qui peut intercaler l’ADN d’organismes non viables (ou endommagés par la membrane) mais qui est exclu des bactéries viables. Après activation de la lumière, la PMA se lie de manière covalente à l’ADN, empêchant son amplification par PCR. Après une exposition à la lumière, la PMA non liée ne peut plus interagir avec les molécules d’ADN.

Le dosage a d’abord été optimisé à l’aide d’échantillons d’expectorations de bacilles acido-fast (AFB) négatifs dopés de mycobactéries mortes ou vivantes à différentes concentrations. En bref, des cellules vivantes de Mycobacterium fortuitum ont été ajoutées à des échantillons d’expectorations décontaminées à la N-acétyl-cystéine négatifs pour la BFA par microscopie à frottis à une concentration finale de 106 bactéries * mL-1. Une aliquote de cet échantillon fabriqué en laboratoire a été traitée pour tuer à la chaleur les cellules de M. fortuitum. La solution mère PMA a été préparée et stockée à -20 ° C et protégée de l’exposition à la lumière, jusqu’à son utilisation, comme recommandé par les fabricants. PMA a été ajouté en prétraitement à une concentration finale de 500 µM et incubé pendant 30 min à 4 ° C dans l’obscurité, suivi d’une exposition à la lumière à diode électroluminescente bleue (LED) – lumière active (GenIUL, Terrassa, Espagne) pendant 15 min à température ambiante. L’ADN a ensuite été extrait à l’aide d’une procédure standard de chloroforme au phénol. Comme témoin pour évaluer l’efficacité de l’étape d’exposition à la lumière, une aliquote d’ADN nu extraite d’une culture de M. fortuitum a été traitée avec une PMA de 500 µM préalablement exposée à la lumière LED pendant 15 min. L’essai de ligne-sonde commerciale (GenoType® Mycobacterium CM; Hain Lifescience, Nehren, Allemagne) a ensuite été réalisé afin d’identifier des espèces mycobactériennes cliniquement pertinentes. Échantillons contenant du M vivant. fortuitum a montré un profil d’hybridation normal sur une bande de nitrocellulose, alors que les échantillons traités pour tuer les bactéries n’ont montré aucune amplification, à l’exception du contrôle interne (données non représentées). Étant donné que l’ADN nu traité avec la PMA inactivée par la lumière présentait un profil d’hybridation normal, l’étape d’exposition à la lumière était efficace et la PCR n’était plus inhibée par la PMA résiduelle.

Après avoir optimisé le protocole d’inactivation de l’ADN issu de bactéries mortes, nous l’avons adapté au test automatisé Xpert® MTB/RIF (Cepheid, Sunnyvale, CA, USA). La PCR en temps réel réalisée par le Xpert® MTB/ RIF fournit des cycles de seuil (Ct) qui peuvent être utilisés pour calculer la différence de rendement d’amplification entre les échantillons avec et sans prétraitement PMA (ΔCt): un ΔCt faible indique la présence d’ADN amplifiable provenant de bactéries vivantes, tandis qu’un ΔCt élevé indique que l’ADN cible de l’échantillon provient de bactéries mortes ou endommagées et, par conséquent, le prétraitement PMA affecte de manière significative son amplification. Pour calculer la valeur ΔCt, nous avons considéré la moyenne entre les valeurs Ct fournies pour chaque sonde incluse dans le test Xpert® MTB /RIF (A à E).

Nous avons testé le protocole PMA à l’aide du test Xpert® MTB /RIF sur une courbe d’étalonnage Ct d’échantillons cliniques AFB négatifs avec des mycobactéries tuées par la chaleur /vivantes ajoutées dans différents rapports. Des rapports morts–vivants élevés ont entraîné une différence maximale des valeurs de ΔCt entre les parties traitées thermiquement et vivantes avec PMA, alors que les échantillons contenant un pourcentage similaire de bactéries tuées et vivantes ne pouvaient pas être différenciés les uns des autres par l’utilisation d’un prétraitement PMA (données non présentées). Des données similaires ont été rapportées par Kralik et al. .

Enfin, nous avons testé l’approche sur des échantillons cliniques. 10 patients ayant reçu un diagnostic de tuberculose pulmonaire active (frottis d’expectoration positif et culture positive) ont été inclus dans la première étude de validation. Des échantillons ont été prélevés au moment du diagnostic (t0) et après 10 à 20 jours de traitement (t1), de la N-acétyl-cystéine décontaminée et traitée pour la culture liquide MGIT-960 (BD Diagnostic Systems, Sparks, MD, USA) selon les directives internationales. Tous les patients étaient toujours positifs à l’AFB par microscopie à frottis d’expectorations à t1. En parallèle, 250 µL d’échantillons décontaminés ont été traités pour une analyse moléculaire par test Xpert® MTB/RIF avec et sans prétraitement PMA. Les échantillons ont ensuite été traités conformément aux instructions du fabricant pour le test Xpert® MTB/RIF.

Comme le montre la figure 1, la PMA n’a pas affecté de manière significative le rendement en PCR des échantillons prélevés à t0 (moyenne ±sem ΔCt 2,3 ± 0,5), alors que les échantillons prélevés pendant le traitement à t1 ont montré un ΔCt de 10,5 ± 0,9 après le traitement par PMA (p = 0,0003) confirmant que la positivité du frottis d’expectoration de ces échantillons était principalement due à des bactéries très endommagées. De plus, le ΔCt calculé entre t0 et t1 dans des échantillons non traités par PMA s’est avéré trop faible (ΔCt 2,9 ±0,9) pour apprécier une diminution réelle de la charge bactérienne due au traitement.

Deux patients notés « faible » à t0 par le Xpert® ont montré une culture négative à t1, alors que tous les autres patients notés ”moyen » ou ”élevé » sont restés positifs à la culture par MGIT. Bien qu’un temps exact de positivité ne puisse pas être évalué, nous avons observé que les cultures d’échantillons prélevés à t1 sont devenues positives environ 7 à 10 jours plus tard par rapport aux cultures d’échantillons prélevés à t0, suggérant une réduction sévère de la charge bactérienne vivante.

Tous les patients ont été traités et guéris avec succès à la fin du traitement, ce qui était compatible avec la réduction des bactéries vivantes détectées par le test PMA.

En tant que témoin négatif, nous avons également inclus rétrospectivement un cas d’échec du traitement (AFB positif et culture positive après 5 mois de traitement standard). Dans ce cas, le prétraitement PMA des deux échantillons d’expectorations décontaminés prélevés à 1 mois et deux pendant le traitement n’a pas affecté de manière significative le rendement PCR (ΔCt ∼2), ce qui soutient l’inefficacité du traitement antituberculeux.

Le même protocole devrait, en principe, être compatible avec d’autres tests moléculaires approuvés par la CE et des tests de sonde de ligne approuvés par l’Organisation mondiale de la Santé pour le diagnostic de la tuberculose; des études supplémentaires sont nécessaires pour exclure cette possibilité.

Des études antérieures ont démontré la possibilité d’utiliser la PMA pour distinguer les mycobactéries vivantes des mycobactéries mortes en utilisant une concentration de 25 à 50 µM. Lors de la mise en place du protocole, une concentration finale de 100 µM a complètement évité l’amplification de l’ADN dérivé de M. fortuitum tué par la chaleur; un fond faible dû à l’amplification de l’ADN de M. tuberculosis tué par la chaleur a été observé (données non montrées). Nous pouvons supposer que la composition différente de la paroi cellulaire affecte d’une manière ou d’une autre la capacité de la PMA à pénétrer les mycobactéries endommagées. En effet, Kralik et al. observé que la réduction du signal induite par la PMA entre Mycobacterium avium subsp vivant et mort. les paratuberculoses étaient plus faibles que celles observées chez d’autres espèces bactériennes. De plus, compte tenu de la quantité de débris pouvant potentiellement séquestrer les molécules de PMA dans les sputa décontaminées, nous avons augmenté la concentration finale à 500 µM. D’autres études évaluant les différences d’effet du traitement de la PMA sur des souches présentant une composition de paroi cellulaire différente (par exemple, des souches de Beijing) et / ou dans des sputa avec des caractéristiques différentes (par exemple. expectorations contenant du sang) pourrait mieux élucider l’utilité de ce test dans différents contextes cliniques.

Selon LØvdal et al. , une petite proportion de cellules présumées mortes ou gravement blessées ne peuvent pas se développer. La présence d’un petit nombre de cellules fortement blessées mais non cultivables pourrait expliquer pourquoi nous avons toujours un signal positif dans les échantillons prélevés à t1 malgré le prétraitement de la PMA. Le prétraitement de la PMA n’évite pas la détection d’une faible proportion de cellules mortes (faux positif pour un test de viabilité): le test pourrait donc surestimer les mycobactéries viables. Cependant, d’un point de vue clinique, cela représenterait une erreur mineure par rapport au risque (très faible pour ce test) de sous-estimer les mycobactéries viables.

Nos données indiquent, pour la première fois, que les techniques moléculaires quantitatives combinées à la méthode PMA pourraient être une alternative à la microscopie directe et à la culture pour le suivi de la réponse précoce au traitement et pour l’évaluation préliminaire de schémas thérapeutiques personnalisés. L’utilisation de ce test peut permettre une évaluation plus précoce de l’efficacité du traitement, montrant une nette diminution de la charge mycobactérienne vitale. Cependant, l’absence de réponse au traitement pourrait également être rapidement identifiée par le test permettant un changement de régime et limitant la propagation de l’infection et le développement ultérieur de la résistance.

• 2 ERS 2012