A lítium-klorid szisztémás hatásmechanizmussal hatékonyan megöli a varroa destruktor mézelő méh parazitát
kísérleti vizsgálat: RNAi-tól lítium-kloridig
egy kísérleti vizsgálatban az atka által fertőzött mézelő méheket ketrecbe zárták és szacharózsziruppal etették, amely potenciálisan esszenciális Varroa gének dsrns-ét tartalmazta (S1 kiegészítő táblázat). Egyszerű szacharózszirup (kezeletlen) és dsrns-sel ellátott szirup, amely a zöld fluoreszcens fehérje GFP (dsgfp ctrl) kódolási szekvenciáján alapul. A GFP-t az Aequorea victoria biolumineszcens hidrozoán medúza fejezi ki. A GFP szekvenciát azért választottuk kontrollnak, mert a mézelő méhek vagy a Varroa atka genomjában nincs homológ gén. A kezeletlen csoportban az atkák mortalitása <5% volt. Ezzel szemben a méhek összes atkája, amely a Varroa géneket célzó dsrns-t tartalmazó szacharózoldatot kapott, három napon belül hatékonyan elpusztult. Az atkákra gyakorolt azonos hatást azonban megfigyelték egy kontroll kísérletben, amelyben a méheket táplálták GFP dsrns (kiegészítő ábra. S1). Ezek az eredmények kizárták a javasolt RNAi által közvetített mechanizmust, de vagy az RNS még ismeretlen hatását, vagy más komponensek aktivitását sugallták a tesztoldatban. Mivel a dsrns-ek előállításához nagy koncentrációban lítium-kloridot (LiCl) használtunk, ezért a méheknek a dsrns-sel együtt etettük, úgy döntöttünk, hogy a LiCl-t szacharózoldatban etetjük ketrecbe zárt méheknek, hogy teszteljük annak aktivitását Varroa atkák ellen. Meglepő módon a LiCl 25 mM-es koncentrációban, amely megfelel a dsrns-oldat számított koncentrációjának, ugyanolyan hatékonyan ölte meg az atkákat, mint a dsrns-t tartalmazó vizsgált anyagok. Továbbá, miután a LiCl-t nagymértékben eltávolították a dsrns-ből kiterjedt mosással (mosott dsgfp ctrl), A miticid aktivitás jelentősen csökkent, amint azt a késleltetett megjelenés és a csökkent aktivitás jelzi (kiegészítő ábra. S1). Ezekből az adatokból arra a következtetésre jutottunk, hogy a LiCl, nem pedig az RNS leütése közvetítette a Varroa atkák megfigyelt aktivitását, és hogy érdemes lenne elemezni a LiCl mint varroacid potenciálját.
A lítium-klorid hatékony koncentrációja
kísérleti Vizsgálatunk elsődleges megfigyeléseinek alátámasztására ketreckísérleteket hoztunk létre a licl különböző koncentrációival a robusztus statisztikai elemzés érdekében. A kísérleti vizsgálatban eredményesnek talált 25 mM-es koncentráció mellett 2 mM-es, 4 mM-es és 10 mM-es koncentrációkat használtunk az alacsonyabb hatásossági küszöb meghatározásához. Az eredmények alátámasztották az előző vizsgálat eredményeit, és szignifikáns miticid hatást mutattak a 2 mM-es LiCl-koncentrációknál, amelyeknél az atkák mortalitásának jelentős növekedése volt megfigyelhető (P < 0,001, log-rank teszt; S2 kiegészítő táblázat). A magasabb, 10 mM-es és 25 mM-es koncentrációk egyaránt jelentősen növelték az atkák elhullását a kezelés második napjától kezdve, és a kísérlet végén a kezelt atkák több mint 96% – át elpusztították (ábra. 1a, S2 kiegészítő táblázat). A Takarmányoldatban LiCl nélkül végzett kontrollkísérletekben az atkák mortalitása átlagosan 9,3% – ot ért el, ezért jóval a kezeletlen ketrecben tartott atkák mortalitási arányának tartományában volt különböző környezeti körülmények között33. Ezen eredmények alapján megerősítettük a LiCl egyértelmű hatását az atkák életképességére 2 mM és 25 mM közötti koncentrációs tartományban.
ezekben a kísérletekben a ketrecbe zárt méheket a megfelelő LiCl-koncentrációval etették néhány napon keresztül, amíg az összes atkát el nem pusztították a kezelés. A méhészeti gyakorlatban való esetleges alkalmazás esetén azonban rövidebb és meghatározott kezelési időszak lenne előnyösebb. Ezért egy további kísérletet végeztünk, amelyben a leghatékonyabb koncentráció 25 mM LiCl (ábra. 1a) 24 órán át adták be, majd további hat napig cukoroldattal etették. A megfigyelési időszak végén 92.Az atkák 9%-A (n = 225 atka, P < 0,001, log-rank teszt) elpusztult anélkül, hogy a kezelt méhekre jelentős hatást gyakorolt volna (lásd a következő bekezdést). Ez az eredmény egyértelműen bizonyítja, hogy még egy rövid távú 25 mM-es LiCl etetés is elegendő az atka populáció jelentős csökkentéséhez.
a méhek által a parazitáló atkák elpusztításához szükséges LiCl-mennyiség pontos meghatározásához 12 újonnan kikelt méheket mesterségesen tápláltak 10 db 4 mm-től 100 mM-ig terjedő LiCl-oldattal, és öt napig külön-külön tartották őket egy faretikus atkával a ketrecekben. A 4 mM-es, illetve 10 mM-es oldatok esetében, amelyek 1,7, illetve 4,2 GB LiCl felvételnek feleltek meg, a hatás nem különbözött szignifikánsan a kezeletlen kontrolltól (n = 12 atka, P = 1.000, log-rank teszt, S3 kiegészítő táblázat). Azonban egyetlen 25 mM-es adag, amely a méh által elfogyasztott 10,6 GB LiCl-nek felel meg, elegendő volt ahhoz, hogy a phoretikus atkák 100% – át 48 órán belül elpusztítsa (ábra. 2).
a méheken tartott phoretikus Varroa atkák mortalitása, amelyeket egyenként tápláltak 10 db lítium-klorid oldattal 4 mM-től 100 mm-ig terjedő koncentrációban a méheket a kísérlet elején csak egyszer etették licl-lel, majd öt nap alatt szacharózszirupot kaptak. Minden egyes koncentráció esetében 12 ketrecet elemeztek, mindegyikben egy-egy méh és egy Varroa atka volt. Az atkák túlélése szignifikánsan csökkent a kontrollcsoporthoz képest, amikor a méheket 25 mM-es vagy annál magasabb koncentrációval etették (P < 0,001, log-rank teszt).
a dolgozó méhekre gyakorolt hatás
a LiCl munkaméhekkel szembeni tolerálhatóságának elemzéséhez az atkák elhullásának elemzésére használt vizsgálati ketrecek (ábra. 1a) ezenkívül a dolgozó méhek mortalitását is feljegyezték. 2 mM-es, 10 mM-es és 25 mM-es LiCl-expozíciót követően, amelyekről kimutatták, hogy miticid hatást fejtenek ki, a kezelt dolgozó méhek elhullása átlagosan 3-7% volt a különböző takarmányozási csoportokon belül. A 10 mM-es LiCl-csoport kivételével (n = 12 ketrec, P = 0,015, log-rank teszt; S4 kiegészítő táblázat) az értékek nem különböztek szignifikánsan a kezeletlen kontrollcsoport 4% – os mortalitásától. Továbbá kontrolljaink elhullási aránya jóval a toxikológiai vizsgálatok során kontrollként megkövetelt, nem kezelt ketrecméhek elhullási tartományán belül volt34, ezáltal megerősítve vizsgálati rendszerünk érvényességét. Szintén a 24 órás LiCl-kezelés nem befolyásolta a dolgozó méhek mortalitását (ábra. 1b; n = 9 ketrec, P = 0,308, log-rank teszt). A LiCl méhekkel szembeni jó tolerálhatóságát egyetlen adag etetése is megerősítette(az atkák mortalitását lásd. 2) ez nem váltotta ki a dolgozó méhek mortalitásának jelentős növekedését (P = 1.000, log-rank teszt; S5 kiegészítő táblázat).
ezután a LiCl különböző koncentrációit folyamatosan etettük az utolsó ketrecbe zárt méh haláláig, hogy megvizsgáljuk a hosszú távú expozícióra adott választ. Itt a kezelés jelentősen csökkentette a frissen kikelt munkaméhek átlagos élettartamát a kezeletlen kontroll ketrecekben töltött 26 napról 23, illetve 22 napra 2 mM, illetve 10 mM LiCl esetén (n = 60 méh, P = 0,024, log-rank teszt; S6 kiegészítő táblázat). Azoknál a méheknél, amelyek a legmagasabb, 25 mM-es LiCl-koncentrációt kapták, az élettartam jelentősen, átlagosan 19 napra csökkent (ábra. 3a).
a mézelő méhek mortalitása a lítium-klorid ketrecbe zárt méhek etetése után. a ketrecbe zárt dolgozó méhek Kaplan-Meier túlélési görbéje krónikus LiCl-expozíció során. A 2 mM-es, 10 mM-es és 25 mM-es koncentrációjú LiCl-diétákat ad libitummal etették az utolsó méh haláláig (n = 6 ketrec egyenként 10 méhvel). Az összes kezelt csoport túlélése szignifikánsan különbözött a cukorszirup kontrolltól (P < 0, 01, log-rank teszt Bonferroni korrekcióval). b) a ketrecbe zárt dolgozó méhek Kaplan-Meier túlélési görbéje 24 órás LiCl-expozíció után. A 2 mM-es, 10 mM-es és 25 mM-es koncentrációjú LiCl-diétákat a kikelés utáni első 24 órában ad libitummal etették, majd szacharózsziruppal helyettesítették (n = 12 ketrec, egyenként 10 méh). Az összes kezelt csoport túlélése nem különbözött szignifikánsan a cukorszirup-kontrolltól (P > 0,1, log-rank teszt Bonferroni korrekcióval).
úgy tűnik azonban, hogy a LiCl csak akkor akadályozza a méhek életképességét, ha hosszabb ideig adják be, amint azt egy további kísérlet is jelzi, amelyben a LiCl-t a kikelés utáni első 24 órában etették, majd szacharózsziruppal helyettesítették, amíg az utolsó ketrecbe zárt méh el nem pusztult (ábra. 3b). Itt a frissen kikelt munkaméhek átlagos élettartama 22 nap (10 mM) és 24 nap (kontroll) között mozgott, a kezelések közötti jelentős különbségek nélkül (N = 120 méh kezelésenként, p 0,126, log-rank teszt; S7 kiegészítő táblázat). A ketrecbe zárt méhek adatai alapján arra a következtetésre jutunk, hogy még egy rövid távú LiCl-kezelés is elegendő a Varroa atkafertőzés teljes felszámolásához, csekély vagy semmilyen hatással a dolgozó méhek életképességére. Ezek az ellenőrzött körülmények között végzett ketrecvizsgálatok eredményei sikeres és ígéretes első lépést jelentenek a Varroa kezelés új megközelítése felé. A hatékonyságot és a mellékhatásokat azonban terepi körülmények között meg kell erősíteni.
szántóföldi vizsgálatok lítium-kloriddal mesterséges rajokban
a hozzávetőleges terepi körülményekhez 25 mM-es és 50 mM-es LiCl-t teszteltünk kilenc, dámából és egyenként körülbelül 20 000 méhből álló, tenyészmentes mesterséges rajban. Ezeket a koncentrációkat a ketrecbe zárt méhekkel végzett korábbi kísérletek alapján választottuk ki, a legmagasabb dózist alkalmazva, amelyet a méhek rövid alkalmazási idő alatt (25 mM) még mindig toleráltak. Mivel a szacharózszirup egyenletes eloszlását a körülbelül 20 000 méhből álló teljes mesterséges rajban nehéz lehetett elérni, emellett 50 mM-es LiCl-koncentrációt teszteltünk annak biztosítására, hogy minden méh megfelelő mennyiségű lítiumnak legyen kitéve. Ennek megfelelően a rajokat ad libitummal etettük 25 mM-es LiCl-t (n = 6) vagy 50 mM-t (n = 3) tartalmazó szacharózsziruppal három napig, majd a perizin-t helyileg alkalmazva. A szerves foszfát-kumafoszt hatóanyagként tartalmazó perizin a rendkívül hatékony varroacid, amelyet általában kontroll kezelésként használnak35. Az atkák mortalitását öt nap alatt figyelték meg. A kontroll kezelést megelőzően a 25 mM-es LiCl a mesterséges rajokban jelen lévő atkák körülbelül 90% – át elpusztította (1.táblázat). A magasabb koncentrációjú oldat (50 mM) azonban nem fokozta ezt a hatást (++2 teszt, P = 0,953). Összességében a hatékonyság valamivel alacsonyabb volt a ketrec tesztekhez képest. Az egyik magyarázat az lehet, hogy a LiCl eloszlása több ezer méhcsoporton belül több időt igényel, amíg az utolsó egyes méh elegendő adagot fogyaszt a megfelelő parazitáló atka elpusztításához. Az ilyen hatalmas, 20 000 méhből álló entitások szükséges etetési idejét további kísérletekben kell elemezni.
Egyéb lítiumvegyületek és nem lítiumsók hatásossága
a lítium mint a varroa atkákra gyakorolt hatás aktív komponensének megerősítése érdekében számos lítiumvegyületet teszteltünk, és összehasonlítottuk a miticid hatásokat a nem lítium sókkal. Különösen érdekes volt a lítium-citrát, amely három lítiumionnal, lítium-szulfáttal és lítium-karbonáttal rendelkezik, amelyek két lítiumionnal rendelkeznek, szemben a LiCl-ben csak egy lítiumionnal. A LiCl-hez képest a hatékonyság és tolerálhatóság elemzéséhez további, egy lítiumionnal (lítium-Laktát, lítium-acetát) rendelkező, de eltérő oldhatóságú, kémiai reaktivitású és árú vegyületeket is bevontak. A ketrecben végzett kísérletek során minden vegyület az atkák 100% – át 25 mM-en három (lítium-citrát és lítium-acetát) – négy napon belül (lítium-szulfát, lítium-laktát és lítium-karbonát) eliminálta. Ezenkívül a 4 mM-es tesztoldatok öt (lítium-citrát, lítium-szulfát és lítium-acetát) hét napon belül teljesen elpusztították a phoretikus atkákat (lítium-Laktát), kivéve a lítium-karbonátot (2.táblázat; S8 kiegészítő táblázat).
a dolgozói méhek mortalitása egyik koncentrációban sem nőtt szignifikánsan a kezeletlen kontroll méhekhez képest, kivéve a 25 mM-es lítium-szulfátot és a 25 mM-es lítium-laktátot (S9 kiegészítő táblázat). Ezekkel a kísérletekkel megerősíthetjük, hogy más lítiumvegyületek hasonló potenciállal rendelkeznek szisztémás atkaölő szerként. Ez növelheti az állatgyógyászati készítmény tervezésének rugalmasságát. Figyelembe véve az árat, a lítium-klorid és a lítium-citrát a legolcsóbb vegyületek. A lítium-szulfát kevésbé alkalmas a méhek alacsonyabb tolerálhatósága miatt, a lítium-karbonát pedig a viszonylag alacsony vízoldékonyság miatt.
a lítiumvegyületek koncentrációfüggő hatékonyságának részletesebb vizsgálatához összehasonlítottuk a LiCl–t lítium-citráttal (Li3C6H5O7), amely a legnagyobb különbséget mutatta a molekulánkénti lítiumionok számában, öt különböző koncentrációban, 1 mM-25 mM tartományban. A lítium-citrát minden koncentrációja szignifikánsan magasabb akaricid aktivitást mutatott a LiCl-hez képest, de a méhek elhullásában nem volt különbség (3.táblázat, S9 és S11 kiegészítő táblázatok). Ezért a lítium-citrát még jobb hatóanyagot jelenthet.
lítiummentes kontrollként és a klorid hatóanyagként való kizárásához a nátrium-klorid (NaCl) és a kálium-klorid (KCl) lúgos sókat, valamint a magnézium-kloridot (MgCl) 25 mM-en is teszteltük. nem figyeltünk meg varroacid hatást NaCl vagy KCl esetén (n = 3 sejt, P = 1.000, log-rank teszt, kiegészítő táblázat S12). Az MgCl-lel végzett vizsgálatok során a ketrecbe zárt méhek 100% – A öt napon belül elpusztult (P < 0.001, log-rank teszt), és a méhek csökkenő száma alapján a kísérletet még az atkákra gyakorolt hatás elemzése előtt befejezték. E kísérletek alapján arra a következtetésre jutottunk, hogy a lítium valóban dózisfüggő módon közvetíti az akaricid aktivitást, és hogy a lítium-citrát az összes eddig vizsgált vegyület közül a legkedvezőbb tulajdonságokkal rendelkezik.
A lítiumvegyületek új varroacidként való potenciálja
megmutattuk, hogy nem az eredetileg feltételezett kettős szálú RNS-ek az esszenciális Varroa gének ellen, hanem meglepő módon a lítium sók erős akaricid hatást közvetítenek a Varroa atkákra a ketrecbe zárt méheken és mesterséges rajokban. Így ezek az eredmények azt mutatják, hogy a lítiumvegyületek az akaricid szerek új osztályát képviselik, kiemelkedő potenciállal és a méhek rendkívül jó tolerálhatóságával. Az atkák és a méhek LiCl-re való eltérő érzékenysége még figyelemre méltóbb, tekintve, hogy a hígítási hatások miatt a LiCl koncentrációja a méhek hemolimfájában valószínűleg lényegesen alacsonyabb lesz, mint a méheknek táplált koncentráció.
fontos, hogy eredményeink nem jelentik az rnai-alapú megközelítések akaricid hatásait, amint azt Garbian et al.32 általában a LiCl közvetíti. A dsrns keverékének mézelő méheknek történő etetése után 60 napok, Garbian et al.32 az atkák mortalitásának lassú növekedését regisztrálták, a kezelés végső hatékonysága csak 60% volt. Tekintettel arra, hogy mesterséges rajaink gyorsan és rendkívül hatékonyan reagálnak a LiCl-lel végzett kezelésekre, különböző hatásmechanizmusok valószínűek: míg az RNAi által közvetített hatások hosszú távú hatásokat mutatnak, a lítiumvegyületek független mechanizmust képviselnek, gyorsan kialakulva és nagy hatékonysággal.
varroacidként a LiCl néhány olyan funkciót jelenít meg, amelyek egyedülállóak ebben a kombinációban: i.a LiCl a mézelő méhek etetése révén szisztémásan hat (“könnyen alkalmazható”), ii. vízben oldódik,ezért nem halmozódik fel a Méhviaszban, ami a lipofil tulajdonságokkal rendelkező szintetikus varroacidok hosszú távú kezelési koncepcióinak döntő problémája. 36, 37 iii. a legtöbb lítiumvegyület emlősökre gyakorolt orális toxicitása viszonylag alacsony38. iv. a 2-25 mm-es koncentrációtartományban nincs visszataszító hatása a takarmányoldatra. 39 és v. mérsékelt áron kapható. Nagyon ígéretes az a tény, hogy egyetlen méhenként csak 10 db LiCl 25 mM-es oldatban (amely 10,6 kg LiCl dózisnak felel meg) elegendő a phoretikus atkák elpusztításához. A további kutatások számára kihívást jelent egy intelligens alkalmazási technika kifejlesztése a teljes méretű rajok és kolóniák számára annak biztosítása érdekében, hogy minden méh megkapja a hatóanyag kritikus mennyiségét.
jelenleg nem tudjuk, hogy a LiCl hogyan öli meg a phoretikus Varroa atkákat, és kevés publikáció van a LiCl rovarokra gyakorolt hatásáról40. A humán gyógyászatban a lítiumot az 1870-es évek óta használják, és hangulatstabilizáló szer, amely a mániás epizódok kezelésére és a bipoláris zavar fenntartó kezelésére41 javallt. Terápiás alkalmazásukra való tekintettel a lítiumvegyületeket és toxicitási profiljukat alaposan megvizsgálták. Eddig számos, az anyagcserére, a fejlődésre,a vérképzésre és más folyamatokra ható enzimet javasoltak potenciális célpontoknak42, 43. Ezeknek az enzimeknek fémionokra van szükségük, a lítium pedig versenyképtelen módon fejti ki aktivitását, ami nagy valószínűséggel egy kétértékű kation kiszorításával történik. Kétségtelen, hogy jelenleg nincs arra utaló jel, hogy a lítiumvegyületek megfigyelt miticid hatása összehasonlítható hatásmechanizmusra támaszkodik.azzal is tisztában vagyunk, hogy eredményeink csak az első lépést jelentik egy új állatgyógyászati készítmény kifejlesztése felé. A szabadon repülő kolóniákon végzett helyszíni vizsgálatok ugyanolyan szükségesek, mint a kifejlett méhekre és a mézelő méhekre gyakorolt szubletális és hosszú távú mellékhatások elemzése, valamint a mézben előforduló lehetséges maradékanyag-problémák.
az itt bemutatott eredmények azonban már azt mutatják, hogy a LiCl hatékony és könnyen alkalmazható kezelés a mesterséges és természetes rajok,különösen az Egyesült Államokban a beporzáshoz használt nagyszámú csomagoló méh esetében.11, 44. Ezenkívül a hatásmechanizmus tisztázása új utakat nyithat az állatgyógyászati készítmények célzott fejlesztése előtt a Varroa atkák elleni küzdelem érdekében.