a mikroarray technológia előnyei és korlátai az emberi rákban

a globális génexpresszió mérésének fontossága az emberi rákokban

az átírt gének populációjának jellemzése új kifejezés, a transzkriptom (Su et al., 2002). Ez a koncepció meghatározza az átírt gének teljes készletét, amelyet egy adott faj messenger RNS-ként fejeznek ki. A transzkriptom tehát az RNS-hírvivők univerzumát képviseli, amelyek kódolhatják a fehérjéket. A géneknek csak körülbelül 5% – A Aktív egy adott sejtben egy adott időpontban. A legtöbb gén elnyomott, és ez a kontroll történhet akár transzkripciós, akár transzlációs szinten. Mivel a fehérje expressziójának szabályozása a transzkripció szintjén hatékonyabb, a legtöbb kontroll ezen a szinten zajlik. A sejt génexpressziós profilja meghatározza annak funkcióját, fenotípusát és a külső ingerekre adott válaszát. Ezért a génexpressziós profilok segíthetnek a sejtfunkciók, a biokémiai útvonalak és a szabályozó mechanizmusok tisztázásában. Ezenkívül a betegségsejtek/szövetek génexpressziós profiljai a normál kontrollokkal összehasonlítva elősegíthetik a betegség patológiájának megértését és új terápiás beavatkozási pontokat azonosíthatnak, javítva a diagnózist és tisztázva a prognózist.

az elmúlt néhány évben számos génexpressziós profilozási módszer jelent meg, amelyeket sikeresen alkalmaztak a rákkutatásban. Ezek közé tartozik a differenciális kijelzés, a génexpresszió soros elemzése és a mikroarrays (Velculescu et al., 1995; Granjeaud et al., 1999; Cheng et al., 2002). A mikrosugarak azért váltak fontossá, mert könnyebben használhatók, nem igényelnek nagy léptékű DNS-szekvenálást, és lehetővé teszik több ezer gén párhuzamos számszerűsítését több mintából. A rákok génexpressziós profilozása a mikroarray technológiát alkalmazó kutatások legnagyobb kategóriáját képviseli, és úgy tűnik, hogy ez a legátfogóbb megközelítés a rák molekuláris jellemzésére. Bár a rák fenotípusát csak részben határozza meg transzkriptomja, mégis világos képet ad a sejt fiziológiai állapotáról. Ennek a megközelítésnek az erejét számos rosszindulatú daganattal, köztük a mell, a fej és a nyak, a máj, a tüdő, a petefészek, a hasnyálmirigy, a prosztata és a gyomor rákos megbetegedéseivel végzett vizsgálatok bizonyították (Bhattacharjee et al., 2001; Dhanasekaran et al., 2001; Garber et al., 2001; Tonin et al., 2001; Al Moustafa et al., 2002; Belbin et al., 2002; Chen et al., 2002; Han et al., 2002; Hedenfalk et al., 2002; víziló et al., 2002; Luo et al., 2002a).

számos tanulmány a rák profilozásáról mikroarray analízissel különböző stratégiákat alkalmaztak, mint például a tumor versus kontroll, amelyben a tumor gén expressziós profilját összehasonlítják a megfelelő kontrollmintával annak érdekében, hogy megmérjék a különbségeket és hasonlóságokat mindkét fenotípus között, rák rétegződés, amelyben az azonos ráktípus különböző mintáiból származó génexpressziós profilokat hasonlítják össze, hogy különböző alcsoportokat tárjanak fel a közös szövettani típusú rák molekuláris osztályozásának jobb meghatározása érdekében, és végül a tumor időbeli értékelése, amelyben a gén expressziós profilját összehasonlítják a a progresszió különböző szakaszaiból származó tumorminták expressziós mintáit összehasonlítják, hogy tisztázzák a betegség korai és előrehaladott stádiumai közötti különbségeket. Bár számos tanulmány jelent meg az emberi betegségek mikroarray-elemzéséről, itt bemutatunk néhányat azok közül, amelyek klinikai érdeklődést mutatnak az onkológia iránt.

Microarray és prosztatarák

a közelmúltban számos, a prosztatarák génexpressziós profiljainak jellemzésére szolgáló mikroarray-t használó tanulmány jelent meg. Ezek a vizsgálatok a mikroarray technológiát génfelfedező eszközként használták a genetikai markerek azonosítására, amelyek megkülönböztetik a normál és a rákos prosztata szöveteket. Egy egyszerű mikroarray vizsgálatot végeztek pöttyös membrán tömbök segítségével a normál és rákos szövetek és sejtvonalak elemzésére (Bull et al., 2001). A membrán mikroarray megállapításait korlátozza ennek a technikának a relatív érzéketlensége az alacsony szinten kifejezett átiratok kimutatására, valamint a membránokon elhelyezhető foltok kis száma; ez a tanulmány azonban a prosztatarák jelölt markereit eredményezte további értékelés céljából. Öt publikált tanulmány több ezer gén génexpressziós profilját elemezte normál és prosztata szövetekben, és felügyelet nélküli hierarchikus klaszterezési elemzést használt a minták rendezésére (Dhanasekaran et al., 2001; Luo et al., 2001, 2002b; Welsh et al., 2001a; Singh et al., 2002). Dhanasekaran et al. (2001) képesek voltak megkülönböztetni a normál prosztata, jóindulatú prosztata hiperplázia (BPH), lokalizált prosztatarák és metasztatikus prosztatarák minták segítségével 9,984 elem-foltos mikroarray. Hierarchikus fürtözési elemzés használata, Luo et al. (2001) képesek voltak megkülönböztetni 16 prosztatarákmintát kilenc BPH mintából a génexpressziós profilok különbségei alapján, 6500 elemes foltos cDNS mikroarray-n mérve. Welsh et al. (2001a) a normál és rosszindulatú prosztata szövetminták hasonló válogatásáról számolt be oligonukleotid mikroarray segítségével. Érdekes módon mind az öt csoport azonosította a transzmembrán szerin – proteáz hepsint, amely jelentősen megnövekedett expressziót mutat a rosszindulatú szövetekben a normál prosztata szövetéhez képest (Dhanasekaran et al., 2001; Luo et al., 2001, 2002b; Welsh et al., 2001a; Singh et al., 2002). A prosztatarák számos más jelölt markere, mint például a proto-onkogén PIM1, más vizsgálatokból származik, és potenciális diagnosztikai markerként tovább vizsgálják. A csökkent PIM1 expresszió a prosztata tumorminták immunhisztokémiáján fokozott kockázatot jelentett a műtét után (Dhanasekaran et al., 2001). A szubtraktív hibridizáció és a mikroarray elemzés kombinációit alkalmazó más csoportok számos potenciális jelöltet azonosítottak a prosztatarák immunmoduláló terápiájára, beleértve a proszteint (Xu et al., 2001), STEAP (Hubert et al., 1999) és P504s/Alfa-Metilacil-CoA-Racemáz (Jiang et al., 2001). Egy nagyon friss tanulmányban, Virolle et al. (2003) prosztatarákos sejtvonalat használt, amely az Egr1 fehérje magas konstitutív szintjét fejezi ki, amely transzkripciós faktor az agresszív tumorigén prosztatarákos sejtek többségében túlexpresszált. Az Egr1 transzkripciós szabályozását egy oligonukleotid mikroarray analízis elvégzésével értékelték az Egr1-ben hiányos sejtek felhasználásával összehasonlító mintaként az Egr1 célgének azonosításához. Ez a tanulmány először a prosztata szöveteiben megerősítette az Egr1 növekedésfokozó szerepét, amelyet korábban más sejtrendszerekben is megfigyeltek, és számos új célgént azonosított, amelyek kifejezetten a növekedést, a sejtciklus progresszióját és az apoptotikus útvonalakat szabályozzák.

mikroarray és szájüregi rák

a mai napig csak néhány, a szájüregi rák szempontjából releváns mikroarray-vizsgálatot tettek közzé. Chang et al. (1998) illusztrálta a cDNS mikroarray-k használatát a transzformációval kapcsolatos gének jellemzésére a szájüregi rákban. Villaret et al. a komplementer DNS-kivonás és a mikroarray elemzés kombinációját alkalmazta a fej és a nyak laphámsejtes karcinómájára (HNSCC) specifikus egyedi gének értékelésére, mint potenciális tumor markerek és vakcinajelöltek. Kilenc ismert gént találtak szignifikánsan túlexpresszált a HNSCC-ben a normál szövethez képest. Ezenkívül négy új gént túlexpresszáltak a daganatok egy részhalmazában (Villaret et al., 2000). Alevizos et al. (2001) elemezte a transzkriptomot a szájüregben laphámsejtes karcinóma. Körülbelül 600 jelölt gént (onkogéneket, tumorszuppresszorokat, transzkripciós faktorokat, differenciálódási markereket, metasztatikus fehérjéket és xenobiotikus enzimeket) találtak, amelyek differenciáltan expresszálódtak a szájüregi rákban, és ezek közül csak hármat igazoltak PCR-rel.

Lu et al. (2001) a microarray megközelítést alkalmazta a génexpressziós profil változásainak értékelésére a nyelőcső laphámsejtes karcinóma megindítása és progressziója során. Megvizsgálták a génexpressziós profilokat a nyelőcsőrák megindításának és progressziójának különböző szakaszaiban annak érdekében, hogy azonosítsák a géneket, amelyek e szakaszok között különböznek egymástól. Frierson et al. (2002) oligonukleotid mikroarray analízist használt 8920 különböző emberi gén expressziójának tanulmányozására 15 adenoid cisztás karcinómában (ACC), egy ACC sejtvonalban és öt normál fő nyálmirigyben. Az ACC-ben megváltozott expresszióval rendelkező gének között voltak azok, amelyek a sox4 és az AP-2 gamma transzkripciós faktorokat, a kazein-kináz 1-et, valamint az epszilont és a frizzled-7-et kódolták, mindkettő a Wnt/béta-katenin jelátviteli útvonal tagja. Egy nagyon friss tanulmányban, Leethanakul et al. (2003) nagy komplexitású cDNS könyvtárakat hozott létre a laser capture microdissected normal and cancer squamous epithelium segítségével. Ebben a tanulmányban a szerzők bioinformatikus eszközökkel vizsgálták a rendelkezésre álló szekvenciainformációkat, és 168 új gént azonosítottak, amelyek a normál és malignus epitheliumban különböznek egymástól. Sőt, cDNS tömbök felhasználásával bizonyítékot szereztek arra, hogy ezen új gének egy részhalmaza erősen expresszálható a HNSCC-ben.

Microarray és emlőrák

tekintettel az emlőrák klinikai heterogenitására, a microarray technológia ideális eszköz lehet A pontosabb osztályozás megállapításához. A mikroarray-alapú expressziós profilozással végzett kezdeti vizsgálatok kimutatták, hogy képes helyesen osztályozni az ösztrogénreceptor-negatív és az ösztrogénreceptor-pozitív emlőrákot (Perou et al., 2000; West et al., 2001), valamint a BRCA1-hez kapcsolódó daganatok megkülönböztetése a BRCA2-hez kapcsolódó és szórványos daganatoktól (Hedenfalk et al., 2001; van ‘ t Veer et al., 2002).

van ‘ t Veer et al. ez volt az egyik legszélesebb körű és informatív tanulmány, amelyet eddig végeztek. A szerzők 117 elsődleges emlőmintát vizsgáltak meg mikroarray alapú génexpressziós profilozással, hogy prognosztikai profilokat dolgozzanak ki, és összehasonlítsák ezeket az emlőrák ismert prognosztikai markereivel. A változó expressziós profilú 5000 gén közül 70-et azonosítottak az optimális pontosság érdekében a visszatérő betegség előrejelzésében. Ezzel a besorolással a szerzők helyesen jósolták meg a betegség tényleges kimenetelét 65 a 78 beteg közül. Öt jó prognózisú, nyolc rossz prognózisú beteget helytelenül jelöltek ki. Az emlőrák Standard prognosztikai markereit használták a rák kiújulásának kockázatának becslésére és az adjuváns terápiával kapcsolatos döntések meghozatalához. Sajnos a jelenlegi prognosztikai markerek nem azonosítják megfelelően a beteg számára legmegfelelőbb terápiát. A mikroarray megközelítés prediktív ereje sokkal nagyobb, mint a jelenleg alkalmazott megközelítéseké, de ezt prospektívebb klinikai vizsgálatokban kell validálni. Ha ennek a megközelítésnek a prognosztikai értéke megerősítést nyer, az expresszió-profilozó osztályozó a szükségtelenül adjuváns kezelésben részesülő betegek körülbelül négyszeres csökkenését eredményezné (Caldas and Aparicio, 2002).

Martin et al. (2001) leírt egy módszert a keringő emlőrák azonosítására egy kétlépcsős differenciális megjelenítési eljárással és nagy érzékenységű tömbalapú expressziós profilozással. Még akkor is, ha a technika potenciálja ígéretes, érzékenységét és specifitását még javítani kell, és több munkára van szükség a génexpressziós profil kimutatásának klinikai jelentőségének meghatározásához a perifériás vérben. Néhány cikk már bizonyította a kapcsolatot a tumor expressziós profilok között a microarray technológia és a klinikai eredmény között. Például Sorlie et al. (2001) kimutatta, hogy az expressziós profilozás által meghatározott tumor alosztályok megjósolhatják a betegségmentes és a teljes túlélést, és Sotiriou et al. (2002) kimutatta, hogy a kezelés előtti expressziós profilok előrejelezték a kemoterápiára adott klinikai választ egy kis emlődaganat-mintában. Bár a tanulmány Sorlie et al. nagyon provokatív volt, a szerzők nem hasonlították össze a hierarchikus csoportosulással azonosított csoportok prognosztikai értékét a mellrákban jelenleg alkalmazott prognosztikai tényezőkkel. Mivel a rákos gyógyszerrezisztencia a sikeres kemoterápia egyik fő akadálya, a lehetséges molekuláris profil vagy a rákellenes gyógyszerek ujjlenyomata a rákos sejtekben mikroarray technológiával kritikus a kemoterápiás válasz előrejelzéséhez. Kudoh et al. (2000) bizonyította ezt a képességet a génexpressziós profilok változásainak meghatározására egy kemoterápiával kezelt emlőrákos sejtvonalban. Megfigyelték az MCF-7 emlőrákos sejtek expressziós profilját, amelyeket vagy átmenetileg doxorubicinnel kezeltek, vagy kiválasztottak a doxorubicinnel szembeni rezisztencia szempontjából. Ez a tanulmány kimutatta, hogy a doxorubicinnel végzett átmeneti kezelés időfüggő módon megváltoztatta a gének változatos csoportjának expresszióját.

mikroarray és petefészekrák

az elmúlt néhány évben számos kutató érdekes tanulmányokat tett közzé a petefészekrák expressziós profilozásával kapcsolatban. Martoglio et al. (2000) öt normál petefészek és négy rosszul differenciált serózus papilláris petefészek adenokarcinóma minta génexpressziós profilját elemezte. Egy kis’ házon belüli ‘ nejlon membrán cDNS mikroarray alkalmazásával az angiogenezishez kapcsolódó markerek (pl. angiopoietin-1, VEGF), apoptotikus és neoplasztikus markerek, immunválasz-mediátorok és a petefészekrák új potenciális markereinek (pl. cofilin, moesin és neuron-restriktív hangtompító faktor fehérje) általános növekedését találták a rákszövetben. A tanulmány érdekes volt, mert alacsony költségű cDNS-tömböt használtak specifikus utak, például angiogenezis és tumorigenesis tanulmányozására. Mivel problematikus a megfelelő mennyiségű korai petefészek-daganatos szövet elérése, a kutatók különböző stratégiákat alkalmaztak a mikroréteg-elemzéshez általában szükséges szövetmennyiségek megkerülésére. Például Ismail et al. (2000) 864 DNS-elem vizsgálatáról számolt be, amelyet 10 petefészekráksejt-vonallal és öt normál hámsejt-vonallal szűrtek rövid távú sejttenyészet segítségével a petefészek felszíni hámjának kiterjesztésére az RNS-extrakció előtt. Más kutatók in vitro eljárásokkal tisztították a petefészek hámját, például üveghez való ragaszkodás vagy immunomágneses dúsítás (Ono et al., 2000; Welsh et al., 2001b). Ez a két megközelítés azonban torzításokat vezethet be a megfigyelt génexpresszióban. Valójában az első megközelítés (Ismail et al., 2000) tenyésztett rákos sejteket használ, amelyek nem feltétlenül tükrözik az in vivo rákot, mivel a tenyésztési körülmények következtében in vitro másodlagos génexpressziós változások léphetnek fel. A második stratégia (Ono et al., 2000; Welsh et al., 2001b) nagyon hosszú, és a kevésbé stabil RNS-hírvivők lebomlását eredményezheti. Az egyes vizsgálatokban alkalmazott in vitro kultúrákban rejlő lehetséges torzítások elkerülése (Ismail et al., 2000; Matei et al., 2002), más kutatók közvetlenül a műtéti úton reszektált daganatok génexpressziós mintáit tanulmányozták (Shridhar et al., 2001). A kicsi, speciális mikrorétegeknek számos gyakorlati előnye van, és olyan információkat tárhatnak fel, amelyek elveszhetnek a nagyobb mikrorétegekben. Sawiris et al. (2002) egy rendkívül specializált cDNS microarray nevű ‘Ovachip’, és megállapította, hogy ez a mikroarray rendkívül érzékeny a petefészekrák és a vastagbélrák megkülönböztetésére a génexpressziós minták alapján. A petefészekrák biomarkereinek szűrése nagyon fontos a diagnózis késői stádiuma és az ilyen típusú rákhoz kapcsolódó rossz túlélés miatt. A közelmúltban két tanulmány használt microarray technológia azonosítani két túlexpresszált potenciális petefészekrák szérum markerek úgynevezett osteopontin és prostasin, és jelentett előzetes validálása azok használatát a korai felismerés a betegség (Mok et al., 2001; Kim et al., 2002).

Microarray és egyéb rákok

a microarray technológia alkalmazása más emberi rákokra gyorsan bővül. Az úttörő tanulmány Golub et al. (1999) bemutatta az akut mieloid leukémia és az akut limfoblasztos leukémia (ALL) megkülönböztetésének lehetőségét a génexpresszió monitorozása alapján, és azt, hogy a szövettani diagnózisra elvakult szimulált helyzetben a két osztályt csak a génexpressziós minták fedezték fel. Alizadeh et al. (2000) a diffúz nagy B-sejtes limfóma (DLBCL) két formáját azonosította olyan génexpressziós profilok alapján, amelyek a B-sejt differenciálódásának különböző szakaszaira utalnak. Érdekes módon ennek a molekuláris osztályozásnak prognosztikai értéke van, függetlenül a rétegződéstől a szokásos klinikai osztályozással. A lymphoid malignus daganatok génexpressziójának tanulmányozására egy nagy együttműködési csoport létrehozott egy speciális mikroarray-t, a ‘Lymphochip’ nevet, amely olyan génekben gazdagodik, amelyek szelektíven expresszálódnak a limfocitákban és a limfocita funkciót szabályozó génekben (Alizadeh et al., 1999). Ez a csoport ezt a mikroarray-t használta a DLBCL vizsgálatára, és ennek a daganatnak két molekulárisan különböző formáját találta. Ezenkívül bebizonyították, hogy a DLBCL alcsoportok meghatározták a betegek egy alcsoportját, amelynek külön klinikai prognózisa van. Annak a hipotézisnek a tesztelésére, hogy a B-sejtes krónikus limfocita leukémia (CLL) egynél több betegség, Rosenwald et al. (2001) összefüggésbe hozta a CLL génexpressziós mintáit Ig mutációs állapotukkal és más típusú normál és malignus B sejtekkel. Érdekes módon a CLL-ben erősen expresszált géneket a DLBCL-hez képest ekvivalensen fejeztük ki az összes CLL-mintában, függetlenül azok Ig mutációs állapotától. Ez a tanulmány azt sugallta, hogy minden CLL-eset közös transzformációs mechanizmussal és/vagy származási sejtekkel rendelkezik. Egy nemrégiben készült tanulmány (Stratowa et al., 2001) javaslatot tett a lehetséges új prognosztikai markerek listájára, amelyek részt vesznek a limfocita-kereskedelemben, és amelyek a betegség stádiumához és/vagy a beteg túléléséhez kapcsolódnak.

egy nagyon friss tanulmányban Gariboldi et al. (2003) elemezte a bőrdaganatra érzékeny és rezisztens egerek normál szövetében a génexpressziós profilokat annak érdekében, hogy azonosítsák azokat a géneket, amelyek funkcionális szerepet játszanak a genetikai érzékenységben. Ez a tanulmány az Scca2 gén szerepét javasolta, a szerin proteáz inhibitor szupercsalád tagja, a bőrdaganatok genetikai hajlamában.

a melanoma elemzésében a mikroarray technológiát is alkalmazták (Bittner et al., 2000). Ez a tanulmány azt sugallta, hogy az egyes betegek szöveteiben a génexpressziós profilok jelentősen konzerválódhatnak az idő múlásával, és hogy a globális transzkripciós elemzés képes azonosítani a bőr melanoma fel nem ismert altípusait, és megjósolni a kísérletileg ellenőrizhető fenotípusos jellemzőket.

a vastagbélrákos sejteken és szöveteken végzett vizsgálatok kimutatták a kináz gén, a WEE1Hu jelentős szuppresszióját (Backert et al., 1999).

sok transzkriptom megváltozik a tumorral kapcsolatos gének specifikus túlexpressziója után. Például az RB2/p130 tumor-szuppresszor gén adenovírus által közvetített expressziós rendszerét használtuk egy nem kis tüdőrákos sejtvonalban a prb2/p130 által szabályozott specifikus gének azonosítása érdekében (Russo et al., 2003). Mikroarray eredményeink számos olyan gént azonosítottak, amelyek számos sejtfolyamatban részt vesznek, beleértve a sejtosztódást, a sejtjelzést/sejtkommunikációt, a sejtszerkezetet/mozgékonyságot, valamint a génexpressziót és az anyagcserét. Ezek az eredmények új potenciális terápiás biomarkerekre utalnak a tüdőkarcinómában. Ezenkívül egy másik cDNS microarray vizsgálat eredményei azt mutatják, hogy a tumor-szuppresszor gén PTEN túlzott expressziója gátolhatja a tüdőrák invázióját egy génpanel csökkentésével (Hong et al., 2000). A fenti adatok fényében egyértelmű, hogy a mikroarray megközelítés nagyon fontos a különböző tumortípusok elemzésében.