az Embryo Project Encyclopedia
1958-tól 1961-ig Leonard Hayflick és Paul Moorhead az USA-ban kifejlesztettek egy módszert a laboratóriumban az emberi sejtek törzseinek tenyésztésére teljes kromoszómakészletekkel. Korábban a tudósok nem tudtákfenntartani a sejttenyészeteket olyan sejtekkel, amelyeknek két teljes készletük voltkromoszómák, mint a normál emberi sejtek (diploid). Ennek eredményeként a tudósokaz emberi sejtbiológia tanulmányozására törekedtek, mert nem volt megbízható sejtforrás, amely a diploid emberi sejteket képviselte. Kísérleteik során Hayflick és Moorhead tartós emberi törzseket hoztak létre, amelyek megtartották mindkét teljes kromoszómakészletet. Ezután lefagyasztják a tenyészetekből származó mintákat, hogy a sejtek életképesek maradjanak a jövőbeni kutatáshoz. Azt is megjegyezték, hogy a sejtek csak bizonyos számú alkalommal tudtak osztódni, mielőtt lebomlottak és elpusztultak, ezt a jelenséget később Hayflick-határnak hívták. Hayflick és Moorhead kísérlete lehetővé tette a fejlődésbiológia és a humancell törzseken alapuló vakcinák kutatását.
Hayflick az ellenőrzött környezetben lévő sejtek tenyésztésére szakosodott. 1958-ban csatlakozott a Pennsylvaniai Philadelphia Wistar Intézetéhez,egy kutatóintézethez, amely sejtbiológiát ésvírusok, az intézet új igazgatója, HilaryKoprowski meghívására. Koprowski megbízta Hayflicket sejttenyészetek létrehozásávalhasználja az intézet más kutatóinak kísérleteiben. Hayflicklater azonban emlékeztetett arra, hogy kutatási megbízását a sejttenyészetek módszereinek és korlátainak tanulmányozására használta. A sejtek tenyésztéséhez Hayflick toborozta Wistar kollégáját, Paul Moorheadet, aki a sejtek és a kromoszómák szerkezetét és működését tanulmányozta.
a normál emberi sejttenyészetek hosszú élettartamának hiányaa laboratóriumi korlátozott kutatás, amelyet a tudósok végezhetnek. A sejtkultúrákkal a tudósok az üvegáru sejtpopulációit növesztik a kutatásban való felhasználás ellenőrzött körülményei között. A kutatók tipikusan olyan üvegárukban vagy petri-csészékben termesztenek sejtkultúrákat,amelyek növekedési táptalajt tartalmaznak, oldott sókat, cukrokat és más cellnutrienseket tartalmazó oldatot. A huszadik század első felében a kutatók azt feltételezték, hogy minden normális, egészséges sejttenyészetnek megvan az a képessége, hogy a végtelenségig osztódjon az Alexis Carrel biológus által 1912-ben az Egyesült Államokban közzétett korábbi megállapítások alapján. A gyakorlatban azonban a kutatók nem figyeltek meg végtelen osztódást a normál sejtekben.Ehelyett a tenyészetben lévő sejtek végül lebomlottak és elpusztultak. A tudósok azt állították, hogy a sejtek azért bomlanak le, mert kimerítették az összes tápanyag kulturális növekedési közegét, vagy mert a laboratóriumi technikusok nem tudták fenntartani az ideális környezeti feltételeket a sejtnövekedéshez. Az egyetlen emberi sejt, amely folyamatosan osztódottlaboratóriumi beállítások, úgynevezett halhatatlan sejtvonalak, a rákos sejtekből származó sejtek voltak. Ezek a sejtvonalak csak néhány szempontot képviseltek az emberi sejtbiológiában.
a huszadik század közepén az orvosi kutatók nem tudták megmagyarázni, mi okozta a rákot, és sok tudós,köztük Hayflick és Moorhead, feltételezte, hogy bizonyos vírusok rákos növekedést okozhatnak. Bár sok mikrobiológus használt rákos sejtvonalakból származó sejteket az orvosi kutatásban, a sejteket általában nem használták vakcinák kifejlesztésében, mert a tudósok attól tartottak, hogy a vakcinák szennyezettek lesznek a rákot okozó vírusokkal, amelyek esetleg magukban a sejtekben találhatók. Ezenkívül a rákos vonalak sejtjei állandó osztódásuk miatt heteroploidok voltak, ami azt jelenti, hogy vagy nagyobb vagy kevesebb kromoszómájuk volt, mint a normál emberi sejteknél, amelyek két teljes kromoszómakészlettel rendelkeznek. A Heteroploid sejtek gyakran származnakfolyamatos sejtosztódás a sejtek sok generációján keresztülkultúra.
Hayflick és Moorehead olyan emberi sejteket hoztak létre, amelyek sok generáción keresztül képesek voltak tenyészteni, mint például a rákos sejtvonalak sejtjei, de megőrizték a sejtek diploid kromoszómaszámát és csökkentették az elméleti rákot okozó vírusok kockázatát. Az 1961-ben megjelent “az emberi DiploidCell törzsek Soros termesztése” című kísérletüket írták le.
Hayflick és Moorhead arra törekedtek, hogy olyan emberi sejttörzseket fejlesszenek ki, amelyeket a laboratóriumban hosszú ideig lehetett termeszteni, de még mindig megtartották a kromoszómák számát. Feltételezték, hogy ha ők volnaka diploid emberi sejtek kis mintáit a már növekvő kultúrákból új növekedési környezetbe ültetik át, akkor jelentősen megnövekedneka diploid sejtek száma a tenyészetben. Hayflick és Moorhead azt javasolta, hogy a diploid sejtek kis mennyiségének fagyasztása megállítja a sejtek növekedését és osztódását anélkül, hogy megölné a sejteket. A fagyasztott sejteket addig lehetett tárolni, amíg a kutatók nem igényelték őket, ekkor meg tudták nézni a fagyasztott sejteket, visszaállítva őket a normális sejtaktivitásra.Hayflick és Moorhead azt jósolták, hogy a felolvasztás után ezek a művelt sejtek nem válnak heteroploidokká, mint más vonalak sejtjei, és megtartják diploid kromoszómakészletüket.
Hayflick és Moorhead kísérlete arra irányult, hogy létrehozzanak egy módszert az emberi diploidsejtek laboratóriumi termesztésére hosszú távú kutatási célokra, és meghatározzák, hogy ezek a sejttörzsek hozzájárultak-e a rákos növekedéshez.Hayflick és Moorhead először laboratóriumi növekedési kultúrákban növesztettek emberi sejteket, kis sejtmintákat ültettek át új tartályokba, hogy további sejttenyészeteket hozzanak létre, és lefagyasztották azokból a kultúrákból származó sejtmintákat, hogy megőrizzék a sejteket a későbbi kutatásokhoz. Ezután annak tesztelésére, hogy a fagyasztott sejtek még életképesek-e a kutatáshoz, Hayflick és Moorhead felolvasztották a fagyasztott sejteket, és megpróbálták sejtkultúrákat növeszteni belőlük.Végül beültették az emberi diploid sejt törzsek mintáitélő szövetekben, hogy lássák, hogy rákos növekedéshez vezettek-e.
a diploid emberi sejttörzsek kifejlesztése érdekében Hayflick és Moorhead 25 különböző szövetből származó sejteket kezdett termeszteni, amelyeket abortált magzatokból nyertek ki. Ezek a sejtek 25 különböző emberi sejttörzsekké váltak, amelyeket numerikusan neveztek el WI-1A WI-25-en keresztül. A WI a Wistar Intézetet jelentette, ahol a cellstraineket fejlesztették ki. Hayflick és Moorhead magzati szöveteket használtmert a felnőtt sejteknél a magzati sejtek könnyebben fejlődneka fibroblaszt sejtekbe, amelyek speciális sejtek, amelyek strukturális támogatást nyújtanak a legtöbb testszövet számára. A fibroblasztsejtek a laboratóriumi sejttenyésztés szempontjából előnyösek voltak, mivel gyorsan növekedtek és folyamatosan növekedtek a sejttenyészetekben, rengeteg sejtet biztosítva a kutatáshoz. Hayflick és Moorhead mindegyik szövetmintát apró, vékony szeletekre vágták, majd a tápanyagban gazdag táptalajjal töltött üvegpalackok belső falára ültették be. Hayflick és Moorhead ezután az egyes sejttörzsek szövetbevonatú palackjait három napig háborús környezetben helyezték el, rendszeresen helyettesítve a táptalajt friss ellátással, hogy megkezdjék a sejttenyészet növekedését.
Hayflick andMoorhead hagyta, hogy a tenyészetek növekedjenek, amíg a sejtek be nem vonják az egész üvegpalackot. A magzati sejtek minden mintáját ezután egy eljárással osztottákúgynevezett szubkultiváció. A szubkultiváció során Hayflick és Moorhead eltávolítottak egy kis sejtmintát, és beültették azokat a sejteket egy új, növekedési táptalajjal töltött üvegfalra, létrehozva egy új sejtkultúrát ugyanazon sejttörzsből. Minden új sejttenyészet új sejtgenerációt hozott létre, amelyet maga is tovább lehet termeszteni ugyanazzal a módszerrel, lehetővé téve a sejtek teljes számának exponenciálisan növekedését. Hayflick és Moorhead ezután kis részekre osztották a megmaradt sejtek mintáit, és lefagyasztották őket, hogy megállítsák a sejtek növekedését és megállítsák a további sejtosztódást.
Hayflick és Moorhead hetente kétszer folytatták a szubkultiváló sejteket, körülbelül tíz hónapig, amikor a sejttenyészetek megálltak és romlani kezdtek.Hayflick és Moorhead feltételezték, hogy a sejtek nem osztódtak szét, mert a sejtnövekedés mérgező termékei felhalmozódtak a növekedési közegben. Hayflick és Moorhead megpróbálták bevezetni a friss growthmedium-ot, amely mentes volt minden lehetséges toxintól, de a sejttenyészetek a következő néhány hónapban tovább romlottak és elpusztultak. Ugyanakkor az ugyanazon növekedési közegbe helyezett más sejttenyészetek nem bomlottak leés meghal. A kutatók arra a következtetésre jutottak, hogy valami a sejtekrőlmaguk, nem a környezetük miatt kezdtek romlani.
Hayflick és Moorhead ezután megkísérelték meghatározni, hogy a lefagyasztott sejtek felhasználhatók-e még több sejtkultúra termesztésére. A sejtek kis mintáinak felolvasztása után Hayflick és Moorhead a sejteket üvegpalackok falára ültette. Újra tenyésztették őket növekedési közegben, és felfedezték, hogy a sejtek még a fagyasztás után is új kultúrákban nőttek fel, amelyek maguk is szubkultiváltak lehetnek. Függetlenül a korábbi fagyasztástól vagy szubkultúráktól,a kutatók diploid emberi sejttenyészetekből származó mintákat használhattak több diploid emberi sejttenyészet termesztésére. Hayflick és Moorhead olyan adiploid emberi sejttörzset hoztak létre, amelyet laboratóriumi kultúrákban szinte határozatlan ideig lehetett termeszteni.
Hayflick és Moorhead ezután azt vizsgálták, hogy az új tenyészetekben termesztett sejtek diploidak-e vagy sem. Amikor a kísérletről írtak, azt mondták, hogy aggódnak amiatt, hogy a sejtek esetleg nem maradtak diploidak, mert sok generáció alatt termesztették őket, ami heteroploidiához vezethet. A fénymikroszkópok segítségével Hayflick és Moorhead a sejtosztódás metafázisa során a sejtmintákat vizsgálta, amikor a kromoszómák megkülönböztethetők éskönnyen megtekinthetők. 250-ben számolták a kromoszómák számátegyéni sejtek, hogy becslést kapjanak arról, hogy hány sejtnek volt még adiploid kromoszómaszáma. Hayflick és Moorhead megállapították, hogy a sejtek több mint 97% – a diploid volt, még több mint húszgenerációs szubkultiváció után is. Hayflick és Moorhead arra a következtetésre jutottak, hogy a magzati sejtek sorozatos tenyésztésének és fagyasztásának folyamata hatékony módszer a diploid emberi sejt törzs megőrzésére.
végül Hayflicknek és Moorheadnek meg kellett mutatnia,hogy sejttörzseik nem okoznak rákot. A rákos sejtekből létrehozott halhatatlan sejtvonalakkal az volt a probléma, hogy a kutatók feltételezték, hogy a sejtek rákot okozó vírusokat tartalmazhatnak. Annak érdekében, hogy megbizonyosodjon arról, hogy a newcell törzsek nem okoznak rákot, Hayflick és Moorhead tesztelte awi-25 sejt törzset az élő szövetben. Azért választották ki a WI-25-ös szűrőt, mert a legtöbb alosztályon ment keresztül, és ez volt a legvalószínűbb, hogy rákot okoz. Ezért, ha nem, valószínű volthogy a többi törzs sem.
a kutatók beültetettéka WI-25 sejttörzsből származó sejteket öt livinghamster arctáskájába. Kísérleti kontrollcsoportként ötöt is beültettekmás hörcsögök arczacskói rákos sejtvonalakból származó sejtekkel. Először megjelentek a csomók, a rák kialakulásának korai jeleia hörcsögök mindkét készletének ellenőrző tasakjában. Három hét után azonban a WI-25 sejtekkel beültetett hörcsögök szinte minden csomója eltűnt, míg a rákos sejtvonalakból beültetett hörcsögök csomói mind megnövekedtek. Hayflickés Moorhead biopsziákat végzett a fennmaradó csomókról, hogy megerősítsékaz előrejelzésük, hogy szubkultivált sejtjeik nem okoznak rákot.A biopsziák azt mutatták, hogy a rákos sejtvonalakból származó sejtekkel beültetett hörcsögök csomói valóban rákosak voltak, míg a WI-25 sejtcsomók az implantáció helyén fellépő gyulladás és vérzés miatt következtek be. Hayflick és Moorhead egy hasonló emberi sejtstraint, a WI-1-et is beültettek öt haldokló rákos beteg izomszövetébe.A rákos sejtvonalakból származó sejteket öt másikba is beültettterminális rákos betegek. Mint a hörcsögökben, először a csomók nőttekmindkét csoport implantációs helyén. Néhány nap múlva awi-1 sejtcsomók visszahúzódni kezdtek, míg a csomók megsokszorozódtak a rákos sejtvonalakból származó sejtekkel beültetett betegek. A hét végén szinte az összes WI-1 csomó eltűnt, Hayflick és Moorhead pedig mindkét csoportban biopsziát végzett a fennmaradó csomókról. A biopsziák eredményei azt mutatták, hogy a rákos sejtcsomók heteroploidsejtek voltak, míg a WI-1 csomók diploidak és nem rákosak. Hayflickand Moorhead megállapításai, amelyeket 1961-ben tettek közzé,bebizonyították, hogy az emberi diploid sejtek sok generáción át terjedhetnek, mint például a rákos sejtvonalak, anélkül, hogy heteroploidokká vagy rákosakká válnának.
Az eredmények azonnali és tartós hatást gyakoroltak a fejlődésbiológia és a tudományos kutatás megértésére. Kísérletük eredményei cáfolták Carrel 1912-es hipotézisét, miszerint a normális sejtek a kultúrában végtelenségig növekedtek, annak ellenére, hogy a sejtkultúrák idővel lebomlottak. Carrel azt javasolta, hogy a sejtek a gyakorlatban romlani látszanak, és az életkor túlórája a sejtek tökéletlen laboratóriumi növekedési feltételeinek köszönhető.Carrel azt állította, hogy ideális körülmények között a kultúrák sejtjeia végtelenségig osztódnak, hatékonyan halhatatlan sejtvonalként működnek.Hayflick és Moorhead megállapításai azonban azt mutatták, hogy az öregedő inorganizmusok sejtszinten történnek,ezt az öregedési folyamatot nevezik öregedésnek, és hogy a sejtek csak korlátozott számú osztódáson mennek keresztül, mielőtt lebomlanak és elpusztulnak. Kísérletük során Hayflick és Moorhead megkísérelte a magzati sejtek folyamatos tenyésztését, a régi growthmedium helyettesítését friss, tápanyagban gazdag táptalajjal. Ezt azonban megállapítottákkörülbelül negyven vagy hatvan generáció után a sejtek inkább elhaltak, mint szaporodni, ezt a jelenséget később Hayflick-határnak hívták. Ez az eredmény azt mutatta, hogy a sejtek még ideális körülmények között sem képesek végtelenségig növekedni a kultúrában.
Hayflick és Moorhead módszere az emberi diploid sejtek soros termesztésében szintén segített a tudósoknak a diploid emberi sejtek bőséges készletének fenntartásában a kutatáshoz. Hayflick és Moorhead számításai szerint egyetlen emberi sejttörzs elég sokszor szubkultiválható ahhoz, hogy közel 20 tonna életképes sejtet termeljen. Bár technikailag nem halhatatlan, ez a kínálat lenneközel a kimeríthetetlen gyakorlati kutatási célokra.
ezenkívül az életképes diploid humán sejtek létrehozása lehetővé tette a vakcinakutatást.Mivel Hayflick és Moorhead kimutatták, hogy emberi sejttörzseik nem okoznak rákot sem hörcsögökben, sem emberekben, ezeket a törzseket vakcinákban lehet használni anélkül, hogy a vakcinát valamilyen rákot okozó szerrel szennyeznék. A későbbi hasonló eredetű emberi sejttörzsek,mint például a WI-38, a gyermekkori betegségek, például a rubeola és a bárányhimlő vakcináinak alapjává váltak.
míg sok kutató üdvözölte az emberi sejttörzsek fejlődését Hayflick és Moorhead által, néhányan,köztük a katolikus egyház, helytelenítette az abortált magzati anyag használatát a vakcinák kifejlesztésében vallási okokból. TheVatican később kijelentette, hogy kifogásolják a magzati szövetekből származó vakcinák kifejlesztésének módszerét, nem pedig azt, hogy az egyén ezeket az oltásokat használja a betegségek megelőzésére.
Hayflick és Moorhead nemcsak azt mutatták ki,hogy az emberi sejtek sikeresen termeszthetők a laboratóriumban, miközben továbbra is fenntartják a diploid kromoszómák számát, hanem azt is, hogy a sejteket szinte határozatlan ideig fenntartják a Soros szubkultiváció révén. Ezenkívül kísérletük megalapozta a Hayflick számára a sejtosztódás határának további kutatását a kultúrában, amelyet később Hayflick-határnak hívtak. Hayflick és Moorhead felfedezései további kísérleteket tettek lehetővé a fejlődésbiológiában és a vakcinák fejlesztésében azáltal, hogy bőséges emberi sejteket biztosítottak a kutatáshoz.