Korai tuberkulózis kezelés monitorozása Xpert által MTB / RIF

a szerkesztőknek:

a tuberkulózis (TB) diagnózis laboratóriumi kapacitásának javítása érdekében elért haladás olyan molekuláris vizsgálatok kifejlesztéséhez vezetett, amelyek most felváltják a hagyományos mikroszkópos és tenyésztésen alapuló módszereket nagy léptékben . Sajnos a jelenlegi molekuláris technikák mind az élő, mind az elhalt baktériumokat kimutatják, és a pozitív eredmény nem jelenti a kórokozó életképességét. Valójában a DNS hosszú ideig fennmaradhat a baktériumok halála után, és az elhalt baktériumok nukleinsavja egyaránt amplifikálható. Ezért a molekuláris vizsgálatok nem alkalmasak a kezelés monitorozására és / vagy fertőzés-ellenőrzési célokra.

innovatív megközelítésről számolunk be az életképes Mycobacterium tuberculosisból származó DNS szelektív amplifikálására klinikai mintákban, amely hasznos a mycobacterium terhelésének monitorozására pulmonalis TB betegeknél az anti-TB kezelés során.

a protokoll a minták propidium-monoaziddal (PMA; Biotium Inc., Hayward, CA, USA), egy kémiai vegyület, amely képes interkalálni a nem életképes (vagy membránsérült) organizmusok DNS-ét, de kizárják az életképes baktériumokból. Fényaktiválás után a PMA kovalensen kötődik a DNS-hez, megakadályozva annak PCR-rel történő amplifikációját . Fényexpozíció után a nem kötött PMA nem képes tovább kölcsönhatásba lépni a DNS-molekulákkal.

a vizsgálatot először savas gyors bacillusok (AFB)-negatív köpetminták alkalmazásával optimalizálták halott vagy élő mikobaktériumokkal különböző koncentrációban. Röviden, élő Mycobacterium fortuitum sejteket adtunk az N-acetil-cisztein dekontaminált köpetmintákhoz, amelyek negatívak az AFB szempontjából kenetmikroszkóppal, 106 baktérium·mL−1 végső koncentrációjában. Ennek a laboratóriumi mintának egy alikvotját úgy kezeltük, hogy hővel elpusztítsa az M. fortuitum sejteket. A PMA törzsoldatot elkészítettük és -20 CC-on tároltuk, és használatig védettük a fénytől, a gyártók ajánlása szerint. A PMA-t előkezelésként adtuk hozzá, 500 GB-os végső koncentrációban, és 30 percig inkubáltuk 4 C-os hőmérsékleten sötétben, majd kék fénykibocsátó dióda (LED) – aktív fény (GenIUL, Terrassa, Spanyolország) 15 percig szobahőmérsékleten. A DNS-t ezután standard fenol-kloroform eljárással extraháltuk. A fény expozíciós lépés hatékonyságának értékelésére szolgáló kontrollként egy M. fortuitum tenyészetből kivont meztelen DNS aliquot-ját 500-mal kezeltük a korábban a LED-fénynek 15 percig. Ezután a klinikai szempontból releváns Mycobacterium fajok azonosítása érdekében elvégezték a kereskedelmi vonal-szondás vizsgálatot (genotípus) Mycobacterium CM; Hain Lifescience, Nehren, Németország). Élő M-t tartalmazó minták. a fortuitum normál hibridizációs profilt mutatott egy nitrocellulóz csíkon, míg a baktériumok elpusztítására kezelt minták a belső kontroll kivételével nem mutattak amplifikációt (az adatok nem jelennek meg). Mivel a fény-inaktivált PMA-val kezelt meztelen DNS normál hibridizációs profilt mutatott, a fényexpozíciós lépés hatékony volt, és a PCR-t a maradék PMA nem gátolta tovább.

miután optimalizáltuk a protokollt az elhalt baktériumokból származó DNS inaktiválására, adaptáltuk az Xpert ++ MTB/RIF automatizált vizsgálathoz (Cepheid, Sunnyvale, CA, USA). Az Xpert által végzett valós idejű PCR MTB / RIF küszöb ciklusokat (Ct) biztosít, amelyek felhasználhatók az amplifikációs hozam különbségének kiszámítására a PMA előkezeléssel rendelkező és anélkül végzett minták között (XXI.ct): az alacsony CCT az élő baktériumokból származó amplifikálható DNS jelenlétét jelzi, míg a magas CCT azt jelzi, hogy a mintában lévő cél DNS elhalt vagy sérült baktériumokból származik, ezért a PMA előkezelés jelentősen befolyásolja annak amplifikációját. A Ccct érték kiszámításához figyelembe vettük az Xpert ++ MTB/RIF tesztben (A-tól E-ig) szereplő egyes szondák Ct-értékei közötti átlagot .

teszteltük a PMA protokollt az Xpert++ MTB/RIF assay segítségével az Afb-negatív klinikai minták Ct kalibrációs görbéjén, hővel elpusztított / élő mikobaktériumokkal, különböző arányban hozzáadva. A magas Holt–élő arányok maximális különbséget eredményeztek a PMA-val kezelt hőkezelt és élő részek között, míg az elölt és élő baktériumok hasonló százalékát tartalmazó mintákat nem lehetett megkülönböztetni egymástól a PMA előkezelés alkalmazásával (az adatok nem jelennek meg). Hasonló adatokról számoltak be Kralik et al. .

végül klinikai mintákon teszteltük a megközelítést. Az első validációs vizsgálatba 10 olyan beteget vontak be, akiknél aktív pulmonalis TBC-t diagnosztizáltak (köpetkenet pozitív és tenyészet pozitív). A mintákat a diagnózis idején (t0) és 10-20 napos terápia után (t1) az N-acetil-ciszteint fertőtlenítették és feldolgozták az MGIT-960 folyékony tenyészethez (BD Diagnostic Systems, Sparks, MD, USA) a nemzetközi irányelvek szerint . Minden beteg továbbra is AFB-pozitív volt köpetkenetmikroszkóppal a t1 – nél. Ezzel párhuzamosan 250 db dekontaminált mintát dolgoztunk fel molekuláris analízis céljából az Xpert ++ MTB/RIF assay segítségével, PMA előkezeléssel vagy anélkül. A mintákat ezután a gyártó utasításai szerint dolgoztuk fel az Xpert ++ MTB/RIF vizsgálathoz.

Mint látható, 1. ábra PMA nem befolyásolta jelentősen a PCR hozam példányok, amelyek a t0 (átlag±sem ΔCt 2.3±0.5), mivel a példányok, amelyek a kezelés során a t1 mutatott ΔCt a 10.5±0.9 után PMA kezelés (p=0.0003), amely igazolja, hogy a köpet kenet pozitivitás ezeket a mintákat volt, elsősorban az erősen sérült baktériumok. Ezen túlmenően a PMA-kezeletlen mintákban a T0 és t1 között kiszámított CACT túl alacsonynak bizonyult (2,9 cc 0,9) ahhoz, hogy értékelni lehessen a baktériumterhelés tényleges csökkenését a terápia miatt.

két, az Xpert által “alacsony” besorolású beteg t0-nál negatív tenyészetet mutatott a t1-nél, míg az összes többi “közepes” vagy “magas” besorolású beteg az MGIT tenyészete pozitív maradt. Bár a pozitivitás pontos ideje nem értékelhető, megfigyeltük, hogy a T1-nél gyűjtött minták kultúrái körülbelül 7-10 nappal később pozitívvá váltak a t0-nál gyűjtött minták kultúráihoz képest, ami az élő baktériumterhelés súlyos csökkenésére utal.

a kezelés végén minden beteget sikeresen kezeltek és meggyógyítottak, és ez összhangban volt a PMA vizsgálattal kimutatott élő baktériumok csökkenésével.

negatív kontrollként retrospektív módon egy kezelési sikertelen esetet is bevontunk (AFB pozitív és tenyészet pozitív 5 hónapos standard kezelés után). Ebben az esetben mind a dekontaminált köpetminták PMA előkezelése a kezelés során 1 hónapon belül, mind két hónapon belül nem befolyásolta szignifikánsan a PCR-hozamot (kb 2), ezáltal támogatva az anti-TB kezelés hatástalanságát.

ugyanennek a protokollnak elvileg kompatibilisnek kell lennie más CE által jóváhagyott molekuláris vizsgálatokkal és az Egészségügyi Világszervezet által a TBC diagnosztizálására jóváhagyott vonali szondákkal; további vizsgálatokra van szükség ennek a lehetőségnek a kizárásához.

korábbi vizsgálatok kimutatták annak lehetőségét, hogy a PMA-t az élő és az elhalt mycobacteriumok megkülönböztetésére használják, 25-50 CBT koncentráció alkalmazásával. A protokoll felállítása során a 100cl-es végső koncentráció teljesen elkerülte a hő által elpusztított M. fortuitumból származó DNS amplifikációját; gyenge hátteret figyeltek meg a hő által elpusztított M. tuberculosis DNS amplifikációja miatt (az adatok nem jelennek meg). Feltételezhetjük, hogy a különböző sejtfal-összetétel valahogy befolyásolja a PMA képességét a sérült mikobaktériumok behatolására. Valóban, Kralik et al. megfigyelték, hogy a PMA által kiváltott jelcsökkenés az élő és az elhalt Mycobacterium avium subsp között. a paratuberculosis alacsonyabb volt, mint más baktériumfajok esetében. Ezen túlmenően, figyelembe véve a törmelék mennyiségét, amely potenciálisan megkötheti a PMA molekulákat a dekontaminált sputában, a végső koncentrációt 500-ra növeltük. További vizsgálatok, amelyek a különböző sejtfal-összetételt mutató törzseken (pl. Pekingi törzsek) és/vagy különböző jellemzőkkel rendelkező sputában (pl. vért tartalmazó köpet) jobban megvilágíthatja ennek a tesztnek a hasznosságát különböző klinikai körülmények között.

szerint L. , a halottnak vagy súlyosan sérültnek vélt sejtek kis része nem képes növekedni. Kis számú, súlyosan sérült, de nem tenyészthető sejt jelenléte megmagyarázhatja, miért van még mindig pozitív jel a t1-ben gyűjtött mintákban a PMA előkezelés ellenére. A PMA előkezelés nem kerüli el az elhalt sejtek kis részének kimutatását (életképességi vizsgálat esetén hamis pozitív): a teszt tehát túlbecsüli az életképes mikobaktériumokat. Klinikai szempontból azonban ez kisebb hibát jelentene az életképes mikobaktériumok alulbecslésének kockázatához képest (ez a teszt nagyon kicsi).

adataink első alkalommal mutatják, hogy a kvantitatív molekuláris technikák a PMA módszerrel kombinálva alternatívát jelenthetnek a közvetlen mikroszkópiával és tenyésztéssel szemben a korai kezelési válasz monitorozásához és a személyre szabott kezelések előzetes értékeléséhez. Ennek a vizsgálatnak a használata lehetővé teheti a kezelés hatékonyságának korábbi értékelését, amely egyértelműen csökkenti a létfontosságú mikobaktérium terhelést. A terápiára adott válasz hiányát azonban a teszt is azonnal azonosíthatja, lehetővé téve a kezelési rend megváltoztatását és korlátozva a fertőzés terjedését és a további rezisztencia kialakulását .

• 2 ERS 2012