PMC

A DNS kettős szálú törései pusztítást okozhatnak a sejtekben, ha nem javítják meg. Ezért azt javasolták, hogy a kromoszómák végei speciális sapkaszerkezetek lehetnek, amelyeket nem ismernek fel kettős szálú törésekként, így megakadályozva a sejtciklus leállását, lebomlását és rekombinációs fúzióját (Muller, 1938; McClintock, 1939). Ma már tudjuk, hogy a telomerek alkotják a kromoszómák végeit, és elengedhetetlenek a genom stabilitásához. A telomerek rövid g-gazdag szekvencia tandem fej-farok ismétléseiből állnak; például az emberi telomerek 2-20 kb (TTAGGG)n ismétlések. A kromoszóma végei nem tompaak, és a 3 ‘ vég (G-gazdag szál) egyetlen szálon túlnyúlik, amely behatolhat a telomer belsejébe, hogy kiszorítsa a belső G-gazdag szekvenciát és T-hurok szerkezetet képezzen (Griffith et al., 1999; Cesare et al., 2003; Doksani et al., 2013), így megvédve a kromoszóma végeit attól, hogy a sejt kettős szálú törésekként ismerje fel, a telomert megkötő fehérjék védelme mellett.

Az eukarióta kromoszómákat félkonzervatív replikáció útján duplikáljuk egy vezető (folyamatos szintézis a nettó növekedéshez a születő vezető szál 3′ végén) és lemaradó (szakaszos Okazaki fragmens szintézis a nettó növekedéshez a születő lemaradó szál 5′ végén) megnyúló szálral, az ábrán látható módon. 1. A kromoszómális semiconservative replikáció során a rövid 5′ RNS primert eltávolítják a születő szálból, és a rést DNS tölti ki, amelyet a szomszédos születő DNS-hez kötnek. A kromoszóma végén azonban az 5′ terminális RNS primer eltávolítása utáni rés a lemaradó szálon nem tölthető ki, és a kromoszóma minden következő replikációs körrel rövidebb lehet. Ezt nevezik a végreplikációs problémának (Watson, 1972; Olovnikov, 1973), és a telomerase segít megoldani ezt a problémát (Greider and Blackburn, 1987; Soudet et al., 2014).

Semiconservative replikáció előtt történik az intézkedés a telomeráz. Korábban azt gondolták, hogy a DNS-replikáció a kromoszómális DNS-ben a telomer ismétlésekkel szomszédos eredetnél kezdődött, a replikációs villák kétirányban elmozdultak a szubtelomer eredettől (ábra. 1 A), így reprodukálja a telomert. A kérdés azonban továbbra is az maradt, hogy a DNS-replikáció bizonyos gyakorisággal elindulhat-e magában a telomerben (ábra. 1 B). Erre a kérdésre most igenlő választ adott ebben a kérdésben Drosopoulos et al., aki a replikált DNS egymolekulás elemzését alkalmazta (SMARD; Norio and Schildkraut, 2001). Ebben a megközelítésben a replikáló sejteket egymás után két különböző nukleotid-analóg jelöli, amelyeket ezt követően immunfluoreszcenciával azonosítanak. Például kétirányú replikáció esetén az első impulzus piros jeleit mindkét végén a második impulzus zöld jelei szegélyezik. A SMARD-ot használó korábbi jelentések arra a következtetésre jutottak, hogy a legtöbb replikáció az egér és az emberi genom szubtelomer régióiban kezdődik, és ritkán magukban a telomerekben (Sfeir et al., 2009; Drosopoulos et al., 2012). Drosopoulos et al. (2015), fluoreszcencia in situ hibridizáció (FISH) a telomer régióból származó szondák segítségével lehetővé tette a replikációs minta elemzését egy 320 kb-os genomi szegmensre az egér kromoszóma karjának végétől 14Q. az első (piros) impulzus hosszú ideje (4 óra) miatt általában csak a telomeren belüli vörös jelvonalakat látták, de mivel sok ilyen molekulának nem volt vörös jele a szubtelomer régióba, kényelmesen arra lehet következtetni, hogy a replikációnak a telomeren belül kell elindulnia (ábra. 1 B). Sőt, egyes molekuláknak piros jelük volt a telomerben, amelyet zöld jel kísér, alátámasztva ezt a következtetést. Bár ezekben az esetekben kromoszóma-proximális zöld jel volt, kromoszóma-disztális zöld jel ritkán volt látható. Így, bár korlátozott bizonyíték volt a telomerből származó kétirányú replikációra, nagyon világos, hogy a replikációs eredet létezhet a telomeren belül egy replikációs villával, amely idővel kiterjed az altelomerbe. Még meg kell vizsgálni, hogy a replikáció viszonylag nagy gyakorisággal indul-e el a 14Q-tól eltérő kromoszómák telomerjeiben.

Ezek az eredmények felvetik a kérdést, hogy a DNS-replikáció eredete egybeesik-e a telomerekben található egyszerű szekvenciaismétléssel, vagy inkább egybeesik-e valamilyen más szekvenciával, amely a telomerben lehet. Az előbbit egy olyan Xenopus sejtmentes kivonatokkal végzett tanulmány javasolja, amelyek össze tudják állítani a pre-replikációs komplexet, és bizonyos DNS-replikáción mennek keresztül exogén DNS-en, amely kizárólag telomer ismétléseket tartalmaz (Kurth and Gautier, 2010). Hasonló következtetéseket vontak le arról, hogy a DNS-replikáció a centromerekben található egyszerű DNS-ismétlődésekben kezdeményezhető, ahol a Drosophila virilisben elektronmikroszkópos replikációs buborékokat figyeltek meg (Zakian, 1976), és egy nemrégiben készült tanulmány azt sugallja, hogy a DNS-replikáció az emberi alfa-műholdas DNS-ben kezdődik (Erliandri et al., 2014).

A replikációs villák lassan mozognak a telomer DNS-en keresztül (Ivessa et al., 2002; Makovets et al., 2004; Miller et al., 2006; Sfeir et al., 2009) a GC-ben gazdag telomer DNS magas hőstabilitása, valamint stabil másodlagos struktúrák, például G-quadruplex (G4) DNS kialakítására való hajlandósága miatt, amelyek problémákat okozhatnak a DNS replikációjában (Lopes et al., 2011; Paeschke et al., 2011). Különböző helikázok segítenek megoldani ezt a problémát; például a Pif1 helikáz segít a g4 lazításában (Paeschke et al., 2013). A Bloom-szindróma helikáz (BLM) és a Werner-szindróma helikáz (WRN) szintén szerepet játszik a telomer replikáció elősegítésében: a BLM elnyomja a replikációtól függő törékeny telomereket (Sfeir et al., 2009), A WRN pedig elnyomja a telomerek lemaradó szálszintézisének hibáit (Crabbe et al., 2004). Drosopoulos et al. (2015) most számoljon be arról, hogy a telomeren belül meginduló vezető szálszintézis lassabban halad a BLM-hiányos sejtekben a subtelomer felé, amint azt SMARD vizualizálja. Sőt, nagyobb volt a replikációs iniciáció gyakorisága a BLM-hiányos sejtek 14Q résztelomerjében, amely közelebb származik a telomerhez, mint a BLM-ben jártas sejtekben. Ezek a megfigyelések arra utalnak, hogy a 14Q szubtelomer szunnyadó replikációs eredete aktiválható, ha a villa progresszióját akadályozzák a BLM-hiányos sejtekben (ábra. 1 C). Drosopoulos et al. (2015) A szubtelomer replikáció iniciációjának növekedését is megállapította, amikor a replikációs villa előrehaladását a telomer aphidicolin akadályozta, mint alternatív eszközt a szunnyadó eredet aktiválására replikációs stressz. Amikor a sejteket a g4 phendc3 stabilizátorral kezeltük, a 14Q szubtelomer eredetű tüzelés tovább növekedett a BLM-hiányos sejtekben. Az adatok együttesen a vezető szálszintézis progressziójának lassulását sugallják a 14Q telomer eredetéből (a g-gazdag szülői szál mint sablon), amikor a g4 struktúrák nem oldhatók meg BLM-hiányos sejtekben. A BLM helikáz szerepének további támogatásaként a G4 struktúrák eltávolításában a bg4 antitest fokozott festést mutatott a BLM-hiányos sejtekben (Biffi et al., 2013) a G4 ellen az egész genomban, különösen a telomerekben.

WRN helicase lehet lazítani G4 in vitro (Fry and Loeb, 1999; Mohaghegh et al., 2001). Amikor Drosopoulos et al. (2015) A SMARD-ot a BLM és a WRN kétszeresen hiányos sejtekben végzett replikáció elemzésére használták, a vörös replikációs jel jelentős csökkenését találták a 14Q telomerekben, ami arra utal, hogy a BLM és a WRN között némi funkcionális átfedés van a vezető szálszintézis szempontjából a g-gazdag telomerek szálából. Ezt a következtetést alátámasztva a BG4 antitest több g4-festést mutatott mind a BLM, mind a WRN kétszeresen hiányos sejtekben, mint a csak BLM vagy csak WRN hiányos sejtekben. Ez az első közvetlen demonstráció in vivo a BLM és WRN helikázok hozzájárulásának a g4 struktúrák felbontásában, ami különösen szükséges a telomerekben induló és a G-gazdag szálból másolt vezető szálszintézis progressziójához.