Cheratine in salute e cancro: più semplice di cellule epiteliali marcatori

Espressione di cheratina nel cancro umano. Le cheratine sono normalmente espresse in modo dipendente dal tipo cellulare, dalla differenziazione e dallo stato funzionale, e i tumori epiteliali mantengono in gran parte le caratteristiche dell’espressione della cheratina associate al rispettivo tipo di cellula di origine, quindi le cheratine sono state a lungo riconosciute come marcatori diagnostici nella patologia tumorale. Esempi di cheratine comunemente utilizzate nella diagnosi di neoplasie epiteliali umane sono presentati qui.

Adenocarcinomi, che è, tumori epiteliali derivanti da tessuti ghiandolari, costituiscono il più grande gruppo di umani tumori epiteliali maligni e possono manifestarsi in diversi organi. La capacità di differenziare gli adenocarcinomi in base al loro tessuto di origine è essenziale per la selezione dei regimi di trattamento più appropriati e le cheratine epiteliali semplici sono i marcatori utilizzati prevalentemente a questo scopo. La maggior parte degli adenocarcinomi esprime le cheratine epiteliali semplici K8, K18 e K19, mentre l’espressione di K7 e K20 è variabile. La tipizzazione della cheratina è di particolare significato diagnostico nel caso degli adenocarcinomi colorettali, che analogamente al normale epitelio gastrointestinale sono quasi sempre K20-positivi, ma K7-negativi (o hanno un’espressione K7 inferiore rispetto a K20) (Moll et al., 2008). La co-espressione K20 e K7 è stata riportata come caratteristica dei tumori colorettali più avanzati (Hernandez et al., 2005), mentre sono stati rilevati livelli ridotti di K20 in associazione con un’elevata instabilità dei microsatelliti (McGregor et al., 2004). Pancreas, vie biliari, esofageo e adenocarcinomi gastrici esprimono uniformemente K7 e più variabilmente, ma fino al 65%, K20 (Chu et al., 2000), mentre un fenotipo K7+/K20 è caratteristico degli adenocarcinomi ovarici, endometriali e polmonari (Moll et al., 2008). Gli adenocarcinomi endometriali possono co-esprimere cheratine epiteliali stratificate, come K5, come indicazione di metaplasia squamosa (Chu e Weiss, 2002a). I carcinomi delle ghiandole salivari non squamose e maligne sono anche K7 + / K20 -, ad eccezione dei carcinomi del dotto salivare, che possono essere positivi per entrambe le cheratine (Nikitakis et al., 2004). Inoltre, quasi tutti i tumori della tiroide (sottotipi follicolari, papillari e midollari) e due terzi dei casi di mesotelioma maligno sono K7+/K20 -. Questi ultimi tumori, a differenza della maggior parte degli adenocarcinomi, esprimono costantemente cheratinine di tipo cheratinocita, in particolare K5 e vimentina (Yaziji et al., 2006). Carcinoidi appendiceali e polmonari, carcinomi corticali surrenali, prostatici ed epatocellulari sono negativi sia per K7 che per K20 (Chu e Weiss, 2002b).

La maggior parte degli adenocarcinomi mammari, compresi i sottotipi duttali e lobulari, esprimono costitutivamente K7, K8, K18 e K19. Tuttavia, K8 presenta un pattern di colorazione prevalentemente periferico nel carcinoma duttale rispetto a un pattern perinucleare ad anello nel carcinoma lobulare (Lehr et al., 2000). In adenocarcinomi scarsamente differenziati corrispondenti al sottotipo basale come definito dal profilo di espressione basato su microarray dei tumori al seno (Sorlie et al., 2001), anche le cheratine caratteristiche delle cellule basali dell’epitelio stratificato, come K5/6, K14 e K17, sono espresse. Più recentemente, phospho (Ser73)-K8 è stato identificato come un possibile biomarcatore per l’espressione inferiore di beclin1, e quindi lo stato di autofagia difettoso, nei tumori al seno (Kongara et al., 2010).

Keratin expression è una guida particolarmente utile nella corretta classificazione dei carcinomi a cellule renali (RCCs) (Liu et al., 2007), come RCC a cellule chiare esprimono principalmente K8 e K18 con minore espressione K19, i tumori papillari esprimono fortemente K19 e K7 oltre alla coppia K8/K18 di base e gli RCC cromofobi esprimono tipicamente K7 e K8/K18, ma poco K19. Gli oncocitomi benigni possono assomigliare istologicamente agli RCC cromofobi, ma sono K7 negativi (Liu et al., 2007). I carcinomi a cellule transizionali generalmente conservano il pattern di cheratina uroteliale mostrando l’espressione combinata di K8 / K18, K7 e K19 insieme a K13 e K20 (Moll et al., 1992).

I carcinomi a cellule squamose, indipendentemente dal loro sito di origine, sono caratterizzati dall’espressione delle cheratine epiteliali stratificate K5, K14 e K17 e delle cheratine iperproliferative di tipo cheratinocitario K6 e K16 (Moll et al., 2008). K1 / K10 può anche essere espresso focalmente, e K4 e K13 in misura minore. Nei carcinomi a cellule squamose scarsamente differenziati, si osserva spesso la co-espressione delle semplici cheratine epiteliali K8, K18 e K19.

L’uso di cheratine come marcatori diagnostici nella patologia tumorale è di gran lunga la loro applicazione più comune nel campo del cancro. Nei casi che rimangono poco chiari sulla base della presentazione clinica e dell’istopatologia convenzionale, compresi i carcinomi scarsamente differenziati o che si diffondono su diversi organi e metastasi di sito tumorale primario sconosciuto, la tipizzazione della cheratina è particolarmente preziosa per una corretta identificazione del tumore e la successiva selezione del piano di trattamento più appropriato.

Marcatori prognostici nei tumori epiteliali

Oltre al loro consolidato ruolo di marcatori diagnostici nel cancro, le cheratine sono state riconosciute anche come indicatori prognostici in una varietà di neoplasie epiteliali (Tabella 2). Ad esempio, nel cancro del colon-retto, l’espressione ridotta di K8 e K20 è stata associata alla transizione delle cellule tumorali da epiteliale a mesenchimale, che è generalmente indicativa di maggiore aggressività tumorale e diminuzione della sopravvivenza del paziente (Knosel et al., 2006). Inoltre, l’espressione persistente o superiore di un frammento K18 scisso con caspasi a Asp396 (prodotto da cellule epiteliali apoptotiche e rilevato da un anticorpo epitopo specifico M30) nel siero di pazienti affetti da cancro del colon dopo resezione tumorale primaria è indicativa di carico tumorale residuo sistemico e correla significativamente con il rischio di recidiva entro 3 anni (Ausch et al., 2009). Livelli più elevati di K18/M30 sierici prima del trattamento sono anche predittivi di una sopravvivenza più breve nei pazienti affetti da cancro del polmone (Ulukaya et al., 2007). Più recentemente, il rapporto tra caspasi scissa (M30) e K18 totale (M65), convenientemente determinato nel siero o nel plasma utilizzando kit di analisi immunoassorbenti enzimatici disponibili in commercio, è stato esplorato come biomarcatore per il monitoraggio dell’efficacia della terapia nei pazienti con carcinoma (Linder et al., 2010). Allo stesso modo, nei pazienti con colangiocarcinoma intraepatico, un’alta concentrazione sierica di frammento K19 (CYFRA21-1) è associata a una diminuzione della sopravvivenza libera da recidiva e globale (Uenishi et al., 2008). L’espressione K20 intratumorale e la positività K20 nel midollo osseo e / o nel sangue sono correlate con una prognosi peggiore negli adenocarcinomi pancreatici (Soeth et al., 2005; Matros et al., 2006; Schmitz-Winnenthal et al., 2006). Inoltre, nel cancro gastrico, la reazione a catena della trascrizione–polimerasi inversa quantitativa in tempo reale per K20 nel liquido di lavaggio peritoneale predice la ricorrenza peritoneale nei pazienti sottoposti a resezione con intento curativo (Katsuragi et al., 2007); La positività K10 e K19 nei carcinomi epatocellulari sono predittori significativi di una sopravvivenza complessiva e libera da malattia più breve dopo la resezione chirurgica (Yang et al., 2008); e l’assenza di differenziazione squamosa come evidenziato dalla perdita di espressione K5/6 è associata a carcinomi endometriali più aggressivi e ridotta sopravvivenza (Stefansson et al., 2006). Nell’RCC a cellule chiare, la co-espressione tumorale di K7 e K19 è associata alla mancanza di alterazioni citogenetiche, basso grado nucleare e migliore esito clinico (Mertz et al., 2008), mentre il rilevamento di cellule tumorali circolanti K8/18-positive è correlato allo stato linfonodale positivo, alla presenza di metastasi sincrone al momento della resezione tumorale primaria e alla scarsa sopravvivenza globale nel carcinoma a cellule renali (Bluemke et al., 2009). Il rilevamento di cellule tumorali cheratina-positive disseminate nel midollo osseo di pazienti affetti da cancro alla prostata prima dell’intervento chirurgico è un fattore di rischio indipendente per metastasi entro 48 mesi (Weckermann et al., 2009). Nel cancro della pelle, l’espressione di cheratina nel melanoma maligno è di particolare interesse, poiché l’mRNA K18 è sorprendentemente identificato in un terzo dei campioni di tessuto di melanoma ed è un fattore prognostico avverso (Chen et al., 2009).

Nel cancro al seno, il molecolarmente definiti basale-come sottotipo caratterizzata da recettore per gli estrogeni (ER), il recettore del progesterone e human epidermal growth factor receptor-2 negatività, ma epidermal growth factor receptor e il K5/6 positività, è associato con la giovane età del paziente, di alto grado del tumore e la prognosi, compresi libera da malattia e sopravvivenza globale (Cheang et al., 2008; Yamamoto et al., 2009). L’espressione di K17 nei tumori al seno è anche prognostica di scarso esito clinico e questo è indipendente dalla dimensione e dal grado del tumore nella malattia nodo-negativa (van de Rijn et al., 2002). Il rilevamento di cellule tumorali circolanti mRNA-positive K19 prima della chemioterapia adiuvante predice una ridotta sopravvivenza libera da malattia e globale nei pazienti con tumori della mammella precoci ER-negativi, triplicati-negativi e fattore di crescita epidermico umano receptor2-positivi (Ignatiadis et al ., 2007), mentre la presenza di cellule tumorali circolanti K19 mRNA-positive nel sangue dopo il completamento della chemioterapia adiuvante nelle donne con carcinoma mammario precoce di qualsiasi sottotipo indica la presenza di malattia residua resistente alla chemioterapia ed è nuovamente associata a un rischio più elevato di recidiva della malattia e diminuzione della sopravvivenza del paziente (Xenidis et al., 2009). Il profilo di espressione genica ha indicato che K18 è spesso downregulated nel cancro al seno metastatico (Hedenfalk et al., 2001; Zajchowski et al., 2001), una scoperta associata allo stadio e al grado avanzato del tumore, alla micrometastasi del midollo osseo e alla sopravvivenza specifica del cancro più breve e alla sopravvivenza globale (Woelfle et al., 2003, 2004). Inoltre, i prodotti di degradazione ubiquitina-immunoreattiva di K8 e K18 sono rilevati nei carcinomi mammari e possono determinare l’aggressività tumorale (Iwaya et al., 2003).

Ruolo funzionale nella tumorigenesi

Dato il loro ruolo regolatorio emergente nella normale fisiologia cellulare e la loro espressione frequentemente alterata nel cancro, sorge la domanda se le cheratine svolgano un ruolo funzionale nella tumorigenesi epiteliale. Sebbene la maggior parte dei topi keratin KO e transgenici non abbia alcun fenotipo tumorale apparente, la carenza di K8 (nello sfondo FVB) provoca iperplasia e infiammazione del colon-retto (Baribault et al., 1994; Habtezion et al., 2005), e colpisce anche (accorcia) la latenza, ma non l’incidenza o le caratteristiche morfologiche degli adenocarcinomi mammari indotti da polioma medio (Baribault et al., 1997); la sovraespressione umana di K8 provoca alterazioni precoci di tipo neoplastico nel pancreas, tra cui perdita di architettura acinare, displasia e aumento della proliferazione cellulare (Casanova et al., 1999), e correla con l’entità della lesione pancreatica spontanea (Toivola et al., 2008); e infine, l’espressione ectopica di K8 nella pelle provoca iperplasia epidermica nei topi giovani, atipia epidermica e cambiamenti preneoplastici nei topi invecchiati e progressione maligna di tumori benigni della pelle indotti da saggi chimici di carcinogenesi cutanea (Casanova et al., 2004).

Diversi studi hanno fornito prove a sostegno di un ruolo attivo della cheratina nell’invasione delle cellule tumorali e nelle metastasi. La trasfezione di K8 e K18 nelle cellule L di topo, che sono fibroblasti ed esprimono vimentina, provoca la formazione di filamenti di cheratina ed è associata a deformabilità e capacità migratorie e invasive più elevate, indicando che le cheratine possono influenzare la forma cellulare e la migrazione attraverso interazioni con l’ambiente extracellulare (Chu et al., 1993). Allo stesso modo, la co-espressione sperimentale di vimentina e K8 / K18 aumenta l’invasione e la migrazione del melanoma umano (Chu et al., 1996) e cancro al seno (Hendrix et al., 1997) cellule in vitro.

Incubazione di cellule umane di cancro pancreatico con sphingosylphosphorylcholine, una lipidi bioattivi presenti in lipoproteine ad alta densità di particelle rinvenute all’aumento dei livelli nel sangue e ascite maligna da pazienti affetti da cancro ovarico, induce cheratina riorganizzazione, per un perinucleare, struttura anulare, che è accompagnato da K8 e K18 fosforilazione a Ser431 e Ser52, rispettivamente (Beil et al., 2003). Questo cambiamento nell’architettura della rete di cheratina si traduce in una maggiore elasticità cellulare e una maggiore migrazione cellulare, indicando che il rimodellamento della cheratina indotta da sfingosilfosforilcolina può contribuire direttamente al potenziale metastatico delle cellule tumorali epiteliali (Suresh et al., 2005). La deformabilità cellulare è anche aumentata in associazione con alterazioni della rete di cheratina a causa della sfingosilfosforilcolina, probabilmente con conseguente maggiore capacità delle cellule tumorali di invadere il tessuto circostante e permeare attraverso lo stroma, facilitando così la sua fuga dal tumore primario (Rolli et al., 2010). Inoltre, un recente lavoro ha implicato modifiche in cheratina fosforilazione come un fattore che contribuisce alla progressione del cancro del colon-retto, come K8 è un substrato fisiologico di fosfatasi rigenerante del fegato-3, che è noto per promuovere l’invasività e il potenziale metastatico delle cellule di cancro del colon-retto, e l’elevata fosfatasi rigenerante del fegato-3 livelli sono associati con la riduzione o la perdita di fosforilato K8 al invasiva fronte di cancro del colon-retto esemplari e in presenza di metastasi epatiche (Mizuuchi et al., 2009).

Diversi studi hanno esplorato il ruolo delle cheratine nell’invasione delle cellule tumorali studiando l’attivazione del plasminogeno mediata da K8 alla plasmina della serina proteasi, che è coinvolta nel rimodellamento della matrice extracellulare e, come tale, nella progressione tumorale e nelle metastasi. Il plasminogeno viene attivato sulla superficie cellulare dall’attivatore del plasminogeno di tipo urochinasi legato al recettore dell’attivatore del plasminogeno di tipo urochinasi e al dominio C-terminale di K8 che penetra nella membrana cellulare (dominio ectoplasmatico K8), come mostrato nelle cellule di carcinoma epatocellulare e mammario (Hembrough et al., 1995). Anche se improbabile che la cheratina lo rende alla superficie cellulare attraverso la via secretoria regolare (Riopel et al., 1993), un anticorpo monoclonale al dominio ectoplasmatico K8 impedisce il legame dell’attivatore del plasminogeno di tipo urochinasi e inibisce la generazione di plasmina, che a sua volta si traduce in morfologia cellulare alterata, maggiore adesione cellulare alla fibronectina e ridotto potenziale di invasione delle cellule del cancro al seno (Obermajer et al., 2009), indicando che K8 insieme all’attivatore del plasminogeno di tipo urochinasi, il plasminogeno e la fibronectina formano una piattaforma di segnalazione in grado di modulare l’adesione cellulare e l’invasività delle cellule del cancro al seno.

K18 può svolgere un ruolo regolatore nel cancro al seno ormonale reattivo, in quanto può efficacemente associare e sequestrare il gene target ERa e il coattivatore ERa LRP16 nel citoplasma, attenuando così la segnalazione mediata dall’ERa e la progressione del ciclo cellulare stimolata dagli estrogeni nelle cellule tumorali del seno (Meng et al., 2009). Inoltre, difetti di autofagia, che promuovono la tumorigenesi mammaria (Karantza-Wadsworth et al., 2007), risultato in K8, K17 e K19 upregulation nelle cellule tumorali mammarie del topo sotto stress metabolico in vitro e nei tumori mammari del topo allotrapianto in vivo (Kongara et al., 2010), potenzialmente implicando la deregolamentazione dell’omeostasi della cheratina nel cancro al seno difettoso associato all’autofagia, un’ipotesi degna di ulteriori indagini. L’autofagia difettosa è stata anche implicata nell’accumulo anormale di cheratina nel fegato, poiché la formazione di inclusione corporea di Mallory–Denk, che è un reperto comune nei carcinomi epatocellulari, è direttamente influenzata dalla modulazione farmacologica dell’autofagia (Harada et al., 2008).

La cheratina 17, che viene rapidamente indotta negli epiteli stratificati feriti, regola la dimensione e la crescita delle cellule legandosi alla proteina adattatore 14-3-3σ e stimolando la via mTOR, regolando così la sintesi proteica (Kim et al., 2006). Ulteriori prove che le cheratine possono funzionare a monte di mTOR sono fornite da studi su topi con ablazione di tutti i geni della cheratina, dove la letalità embrionale da grave ritardo di crescita è associata a localizzazione aberrante dei trasportatori di glucosio GLUT1 e GLUT3m con conseguente attivazione dell’adenosina monofosfato chinasi e soppressione degli obiettivi a valle di mTORC1 S6 chinasi e 4E-BP1 (Vijayaraj et al., 2009). In una relazione apparentemente reciproca, le isoforme AKT regolano l’espressione del filamento intermedio nelle linee cellulari del cancro epiteliale, poiché la sovraespressione di AKT1 aumenta i livelli di K8 / K18 e AKT2 sovraregola K18 e vimentina (Fortier et al., 2010). Pertanto, le cheratine, che sono spesso espresse in modo aberrante nei tumori epiteliali, interagiscono in diversi modi con la via AKT/mTOR, che a sua volta è spesso anormalmente attivata nei tumori aggressivi, aumentando la possibilità che il ruolo di AKT nella tumorigenesi epiteliale sia almeno parzialmente mediato dalla cheratina e/o dipendente.

Le cheratine sono anche importanti per la segnalazione intracellulare mediata da chaperone, che a sua volta può svolgere un ruolo nella tumorigenesi epiteliale. La PKC atipica è un regolatore chiave evolutivamente conservato dell’asimmetria cellulare, che è stato anche identificato come un oncogene causale del cancro del polmone non a piccole cellule e un fattore predisponente per il cancro del colon, quando sovraespresso (Fields e Regala, 2007). Recenti lavori hanno dimostrato che sia le cheratine filamentose che la proteina da shock termico 70 sono necessarie per la rifosforilazione di salvataggio della PKC atipica matura, regolando così la sua distribuzione subcellulare e mantenendo i suoi livelli e attività allo stato stazionario (Mashukova et al., 2009). Inoltre, dato un eccesso di proteina solubile da shock termico 70, la rete di cheratina doveva essere un passo limitante nel meccanismo di salvataggio atipico di PKC, un’ipotesi confermata in due diversi modelli animali di sovraespressione K8 (Mashukova et al., 2009). In entrambi i casi, le regioni cellulari con accumulo di filamenti intermedi anomali ed eccessivi hanno anche mostrato un segnale PKC atipico attivo grossolanamente mislocalizzato, indicando che l’attività oncogenica della chinasi assistita da chaperone, incluso Akt1, può anche dipendere dalle cheratine e ampliare le conoscenze già disponibili sul ruolo delle cheratine come scaffold chaperone (van den et al., 1999; Toivola et al., 2010).

Sebbene le mutazioni di K8 siano state implicate nella progressione di acuta e cronica (Ku et al., 2001) malattie epatiche, non sono state direttamente collegate all’epatocellulare, al pancreas (Treiber et al., 2006) o qualsiasi altro carcinoma. Ad oggi, l’unico tipo di cheratina e tumore per il quale una specifica variante o polimorfismo a singolo nucleotide è stata associata alla predisposizione del cancro è K5 nel carcinoma a cellule basali (Stacey et al., 2009), come una scansione di associazione di polimorfismo a singolo nucleotide a livello genomico per le comuni varianti di rischio di carcinoma a cellule basali ha identificato la sostituzione G138E in K5 come suscettibilità al carcinoma a cellule basali, ma non al carcinoma a cellule squamose, al melanoma cutaneo o ai tratti di pigmentazione chiara. Dato il numero crescente di studi di associazione a livello genomico per diversi tumori, è possibile che ulteriori varianti di cheratina che influenzano il rischio di cancro specifico possano essere scoperte nel prossimo futuro.

Ruolo nella reattività del farmaco

Le cheratine proteggono le cellule epiteliali dallo stress meccanico, ma forniscono anche resistenza ad altri fattori di stress cellulari che possono portare alla morte cellulare, compresa l’attivazione del recettore della morte e farmaci chemioterapici. Ad esempio, i topi K8 – e K18-null, che mancano di filamenti intermedi di cheratina nei loro epatociti a causa dell’instabilità della cheratina quando manca la cheratina del partner, e gli epatociti coltivati ex vivo da topi K8-null sono più sensibili all’apoptosi mediata da Fas rispetto alle loro controparti wild-type (Gilbert et al., 2001). Allo stesso modo, una mutazione K18 (Arg89Cys) che interrompe la rete di filamenti di cheratina predispone gli epatociti a lesioni apoptotiche mediate dal fattore di necrosi tumorale (Ku et al., 2003b). Questi risultati mostrano chiaramente che K8 e K18 mediano la resistenza all’apoptosi indotta da Fas nel fegato; tuttavia, possono anche essere rilevanti per la terapia del cancro, poiché i livelli di cheratina sono influenzati da farmaci antitumorali, come il mitoxantrone (MX) (Cress et al., 1988) e doxorubicina (Hammer et al. 2010), miselli agonisti del recettore può avere attività antitumorale selettiva, come l’attivazione della via estrinseca la morte delle cellule apoptotic percorso da associazione di apoptosi ligando 2/fattore di necrosi tumorale-correlati che inducono apoptosi ligando cognate recettori di morte risultati nell’apoptosi di diversi tipi di cellule di cancro senza una significativa tossicità verso le cellule normali (Ashkenazi, 2008; Gonzalvez e Ashkenazi, 2010).

Aberrant keratin expression has already been shown to confer a multidrug resistance phenotype, as mouse L fibroblasts are rendered resistant to MX, doxorubicin, methotrexate, melphalan and vincristine, but not to ionizing radiation, upon K8 and K18 transfection (Bauman et al., 1994). Similarly, NIH 3T3 fibroblasts with ectopic K8/K18 expression exhibit resistance to MX, doxorubicin, bleomycin, mitomycin C and melphalan, but not to cisplatin (Anderson et al., 1996). Inoltre, monocyte chemoattractant protein-7 / MX, una linea cellulare di cancro al seno umano selezionata da MX con un fenotipo di resistenza multidrug a causa della sovraespressione della proteina resistente al cancro al seno, presenta anche elevati livelli di K8, che si sinergizzano con la proteina resistente al cancro al seno aumentando la resistenza ai farmaci, probabilmente agendo attraverso diversi meccanismi, poiché l’RNA a forcina corta anti-K8 inverte la resistenza, 2008b). La resistenza multidroga delle cellule chemioattrattanti protein-7/MX dei monocociti è almeno parzialmente dovuta alla loro maggiore adesione alla matrice extracellulare, che è a sua volta mediata dall’espressione di K8 sulla superficie cellulare, indicando che le alterazioni nel livello di espressione e nella localizzazione cellulare di K8 possono diminuire attivamente la risposta al trattamento del cancro (Liu et al., 2008a). Resta da esplorare se la modulazione farmacologica della cheratina possa essere utilizzata in aggiunta alla chemioterapia per migliorare i risultati terapeutici.