cloruro di Litio efficacemente uccide le api da miele parassita Varroa destructor di un sistemico modalità di azione
studio Pilota: Da RNAi di cloruro di litio
In uno studio pilota, acaro-infestato le api da miele sono stati chiusi in gabbia e alimentati saccarosio sciroppo contenente rnads potenzialmente essenziale Varroa geni (Complementare Tabella S1). Sciroppo di saccarosio normale (non trattato) e sciroppo con dsRNA basato sulla sequenza di codifica per la proteina fluorescente verde GFP (dsGFP ctrl) servito come controlli. GFP è espresso nella medusa hydrozoan bioluminescente Aequorea victoria. La sequenza GFP è stata scelta come controllo perché non esiste alcun gene omologo nel genoma delle api da miele o dell’acaro Varroa. Nel gruppo non trattato la mortalità degli acari è stata < 5%. Al contrario, tutti gli acari sulle api che hanno ricevuto una soluzione di saccarosio contenente dsRNA che mira ai geni Varroa sono stati effettivamente uccisi entro tre giorni. Un effetto identico sugli acari, tuttavia, è stato osservato in un esperimento di controllo in cui le api sono state alimentate GFP dsRNA (Fig. S1). Questi risultati hanno escluso il meccanismo mediato da RNAi proposto, ma hanno suggerito un effetto ancora sconosciuto dell’RNA o l’attività di altri componenti nella soluzione di prova. Poiché alte concentrazioni di cloruro di litio (LiCl) sono state utilizzate nella produzione di DSRNA e quindi alimentate alle api insieme al dsRNA, abbiamo scelto di alimentare LiCl in soluzione di saccarosio alle api in gabbia per testare la sua attività contro gli acari Varroa. Sorprendentemente, LiCl a concentrazioni di 25 mm, che corrisponde alla concentrazione calcolata nella soluzione di dsRNA, ha ucciso gli acari con la stessa efficacia delle sostanze di prova contenenti dsRNA. Inoltre, dopo che il LiCl è stato in gran parte rimosso dal dsRNA mediante un lavaggio esteso (dsGFP lavato ctrl), l’attività miticida è stata sostanzialmente diminuita come indicato dall’insorgenza ritardata e dall’attività ridotta (Fig. S1). Da questi dati, abbiamo concluso che LiCl, non RNA knockdown, ha mediato l’attività osservata sugli acari Varroa e che sarebbe utile analizzare il potenziale di LiCl come varroacide.
Concentrazione efficace di cloruro di litio
Per corroborare le osservazioni primarie del nostro studio pilota, abbiamo stabilito esperimenti di gabbia con diverse concentrazioni di LiCl per una solida analisi statistica. Oltre alla concentrazione di 25 mm, che è risultata efficace nello studio pilota, abbiamo utilizzato concentrazioni di 2 mM, 4 mM e 10 mM per determinare la soglia inferiore di efficacia. I risultati hanno supportato i risultati dello studio precedente e hanno dimostrato effetti miticidi significativi per concentrazioni di LiCl fino a 2 mm a cui è stato mostrato un aumento sostanziale della mortalità degli acari (P < 0,001, log-rank test; Tabella supplementare S2). Concentrazioni più elevate di 10 mM e 25 mm hanno entrambi migliorato significativamente la mortalità degli acari a partire dal secondo giorno di trattamento e hanno raggiunto lo sterminio di oltre il 96% degli acari trattati alla fine dell’esperimento (Fig. 1a, Tabella supplementare S2). Negli esperimenti di controllo senza LiCl nella soluzione di alimentazione, la mortalità degli acari ha raggiunto in media il 9,3% ed era quindi ben compresa nella gamma dei tassi di mortalità ottenuti per gli acari tenuti su api da gabbia non trattate in diverse condizioni ambientali33. Basato su questi risultati, abbiamo confermato un chiaro effetto di LiCl su acaro vitalità in un intervallo di concentrazione compreso tra 2 mM e 25 mM.
la Mortalità di phoretic acari della Varroa e le api da miele dopo la poppata, cloruro di litio (LiCl) a gabbia api. (a) Curva di sopravvivenza Kaplan-Meier degli acari Varroa femmina tenuti su api in gabbia alimentate con LiCl in concentrazioni comprese tra 2 mM–25 mM (n = 33, 9, 9, 12 e 9 gabbie per 0 mM (controllo), 2 mM, 4 mM, 10 mM e 25 mm, rispettivamente). A tutte le concentrazioni, la sopravvivenza degli acari nei gruppi di trattamento era significativamente diversa dal controllo (P < 0,001, test di log-rank con correzione Bonferroni). b) Curva di sopravvivenza Kaplan-Meier delle api operaie in gabbia e degli acari Varroa femmina dopo 24 ore di esposizione LiCl (n = 9 gabbie). La sopravvivenza degli acari nel gruppo di trattamento era significativamente diversa dal gruppo di controllo (P < 0,001, log-rank test) ma non vi erano differenze significative di gruppo nella mortalità delle api.
In questi esperimenti, le api in gabbia sono state alimentate con la rispettiva concentrazione di LiCl per diversi giorni fino a quando tutti gli acari sono stati uccisi dal trattamento. Tuttavia, per un potenziale utilizzo nella pratica dell’apicoltura, sarebbe preferibile un periodo di trattamento più breve e definito. Abbiamo quindi eseguito un ulteriore esperimento, in cui la concentrazione più efficace di 25 mm LiCl (Fig. 1a) è stato somministrato per 24 h seguito da alimentazione con soluzione di zucchero per ulteriori sei giorni. Alla fine del periodo di osservazione, 92.il 9% degli acari (n = 225 acari, P < 0.001, log-rank test) sono stati uccisi senza alcun effetto significativo sulle api trattate (vedi paragrafo successivo). Questo risultato dimostra chiaramente che anche un’alimentazione a breve termine di 25 mm di LiCl è sufficiente a ridurre sostanzialmente la popolazione di acari.
Per determinare con precisione la quantità ingerita di LiCl dalle api che è necessaria per uccidere gli acari parassitari, 12 api appena nate sono state alimentate artificialmente 10 µl di soluzioni di LiCl da 4 mM a 100 mm e tenute singolarmente con un acaro foretico per cinque giorni all’interno delle gabbie. Con le soluzioni da 4 mM e 10 mM, che corrispondevano ad un assorbimento di 1,7 µg e 4,2 µg di LiCl, rispettivamente, l’effetto non era significativamente diverso dal controllo non trattato (n = 12 acari, P = 1.000, log-rank test, Tabella supplementare S3). Tuttavia, una singola dose di 25 mm, corrispondente a 10,6 µg di LiCl consumato dall’ape era sufficiente per uccidere il 100% degli acari foretici entro 48 ore (Fig. 2).
la Mortalità di phoretic acari della Varroa tenuto sulle api che singolarmente sono stati alimentati con 10 µl di una soluzione di cloruro di litio in concentrazioni che vanno da 4 mM a 100 mM. Le api sono stati alimentati LiCl solo una volta all’inizio dell’esperimento, quindi hanno ricevuto il saccarosio sciroppo di più di cinque giorni. Per ogni concentrazione, sono state analizzate 12 gabbie con un’ape e un acaro di Varroa ciascuna. La sopravvivenza degli acari è stata significativamente ridotta rispetto al gruppo di controllo quando le concentrazioni di 25 mm e superiori sono state alimentate alle api (P< 0.001, log-rank test).
Effetto sulle api operaie
Per l’analisi della tollerabilità del LiCl alle api operaie, le gabbie di prova utilizzate per analizzare la mortalità degli acari (Fig. 1a) sono stati inoltre registrati per la mortalità delle api operaie. Dopo l’esposizione a LiCl di 2 mm, 10 mM e 25 mM che hanno dimostrato di esercitare attività miticida, la mortalità delle api operaie trattate variava in media dal 3 al 7% nei diversi gruppi di alimentazione. Ad eccezione del gruppo LiCl di 10 mm (n = 12 gabbie, P = 0,015, log-rank test; Tabella supplementare S4), i valori non erano significativamente diversi dal 4% di mortalità nel gruppo di controllo non trattato. Inoltre, i tassi di mortalità dei nostri controlli erano ben all’interno della gamma di mortalità delle api da gabbia non trattate richieste come controllo nei test tossicologici34, confermando quindi la validità del nostro sistema di test. Anche il trattamento 24 h con LiCl non ha influenzato la mortalità delle api operaie (Fig. 1b; n = 9 gabbie, P = 0.308, log-rank test). Una buona tollerabilità di LiCl alle api è stata confermata anche dall’alimentazione di una singola dose (per la mortalità degli acari vedi Fig. 2) che non ha provocato un aumento significativo della mortalità delle api operaie (P = 1.000, log-rank test; Tabella supplementare S5).
Successivamente, diverse concentrazioni di LiCl sono state alimentate continuamente fino alla morte dell’ultima ape in gabbia per studiare la risposta all’esposizione a lungo termine. Qui, il trattamento ha ridotto significativamente la durata media della vita delle api operaie appena schiuse da 26 giorni nelle gabbie di controllo non trattate a 23 e 22 giorni per 2 mm e 10 mm LiCl, rispettivamente (n = 60 api, P = 0,024, log-rank test; Tabella supplementare S6). Nelle api che hanno ricevuto la più alta concentrazione di 25 mm LiCl la durata della vita è stata significativamente ridotta a 19 giorni in media (Fig. 3 bis).
Mortalità delle api mellifere dopo aver somministrato cloruro di litio alle api in gabbia. (a) Curva di sopravvivenza Kaplan-Meier delle api operaie in gabbia durante l’esposizione cronica al LiCl. Le diete LiCl a concentrazioni di 2 mm, 10 mM e 25 mM sono state alimentate ad libitum fino alla morte dell’ultima ape (n = 6 gabbie con 10 api ciascuna). La sopravvivenza di tutti i gruppi trattati era significativamente diversa dal controllo dello sciroppo di zucchero (P< 0,01, log-rank test con correzione Bonferroni). b) Curva di sopravvivenza Kaplan-Meier delle api operaie in gabbia dopo un’esposizione di 24 ore al LiCl. Le diete LiCl a concentrazioni di 2 mm, 10 mM e 25 mM sono state alimentate ad libitum per le prime 24 h dopo la schiusa e poi sostituite da sciroppo di saccarosio (n = gabbie 12 con api 10 ciascuna). La sopravvivenza di tutti i gruppi trattati non era significativamente diversa dal controllo dello sciroppo di zucchero (P > 0.1, log-rank test con correzione Bonferroni).
Tuttavia, LiCl sembra ostacolare ape vitalità solo se somministrato per un lungo periodo di tempo, come indicato da un altro esperimento in cui LiCl è stato alimentato per le prime 24 h dopo la schiusa e fu poi sostituito da saccarosio sciroppo fino all’ultimo in gabbia ape morto (Fig. 3 ter). Qui, la durata media della vita delle api operaie appena schiuse variava da 22 giorni (10 mm) a 24 giorni (controllo) senza differenze significative tra i trattamenti (n = 120 api per trattamento, P ≥ 0,126, log-rank test; Tabella supplementare S7). Sulla base di questi dati provenienti da api in gabbia, concludiamo che anche un trattamento LiCl a breve termine è sufficiente per sradicare completamente l’infestazione da acari Varroa con scarso o nessun impatto sulla vitalità delle api operaie. Questi risultati ottenuti nei test in gabbia in condizioni controllate rappresentano un primo passo positivo e promettente verso un nuovo approccio al trattamento con Varroa. Tuttavia, l’efficienza e gli effetti collaterali devono essere confermati in condizioni di campo.
Test sul campo con cloruro di litio in sciami artificiali
Per approssimare le condizioni di campo, abbiamo testato 25 mm e 50 mm LiCl in nove sciami artificiali senza covata composti da una regina e circa 20.000 api ciascuno. Queste concentrazioni sono state scelte sulla base di precedenti esperimenti con api in gabbia utilizzando la dose più alta che era ancora tollerata dalle api in tempi di applicazione brevi (25 mm). Poiché una distribuzione uniforme dello sciroppo di saccarosio in tutto lo sciame artificiale di circa 20.000 api avrebbe potuto essere difficile da raggiungere, abbiamo inoltre testato una concentrazione di 50 mm di LiCl per garantire che ogni ape fosse esposta a quantità sufficienti di litio. Di conseguenza, gli sciami sono stati alimentati ad libitum con sciroppo di saccarosio contenente 25 mm LiCl (n = 6) o 50 mM (n = 3) per un periodo di tre giorni, seguito da un’applicazione topica di Perizin®. Perizin® contenente l’organofosfato coumaphos come principio attivo, è un varroacide altamente efficace che viene comunemente usato come trattamento di controllo35. La mortalità degli acari è stata monitorata per un periodo di cinque giorni. Prima del trattamento di controllo, 25 mm di LiCl hanno ucciso circa il 90% degli acari presenti negli sciami artificiali (Tabella 1). La soluzione concentrata più alta (50 mm), tuttavia, non ha aumentato questo effetto (prova χ2, P = 0,953). Complessivamente, l’efficacia è stata leggermente inferiore rispetto ai test in gabbia. Una spiegazione potrebbe essere che la distribuzione di LiCl all’interno di un gruppo di migliaia di api richiede più tempo fino a quando l’ultima ape individuale consuma un dosaggio sufficiente per uccidere il rispettivo acaro parassitizzante. Il tempo di alimentazione necessario di tali enormi entità di 20.000 api e più deve essere analizzato in ulteriori esperimenti.
Efficacia di altri composti di litio e sali non di litio
Per confermare il litio come componente attivo per l’effetto sugli acari Varroa abbiamo testato una serie di composti di litio e confrontato gli effetti miticidi con sali non di litio. Di particolare interesse erano citrato di litio, un composto con tre ioni di litio, solfato di litio e carbonato di litio, che hanno due ioni di litio rispetto a un solo ion di litio in LiCl. Per analizzare l’efficacia e la tollerabilità rispetto al LiCl sono stati inclusi composti aggiuntivi con uno lithium di litio (lattato di litio, acetato di litio), ma diversa solubilità, reattività chimica e prezzo. Negli esperimenti in gabbia tutti i composti hanno eliminato il 100% degli acari a 25 mm entro tre (citrato di litio e acetato di litio) a quattro giorni (solfato di litio, lattato di litio e carbonato di litio). Inoltre, le soluzioni di prova da 4 mm, hanno completamente ucciso gli acari foretici entro cinque (citrato di litio, solfato di litio e acetato di litio) a sette giorni (lattato di litio) ad eccezione del carbonato di litio (Tabella 2; Tabella supplementare S8).
La mortalità delle api operaie non è aumentata significativamente a nessuna delle due concentrazioni rispetto alle api di controllo non trattate, ad eccezione del solfato di litio da 25 mm e del lattato di litio da 25 mm (Tabella supplementare S9). Con questi esperimenti potremmo confermare che altri composti del litio hanno un potenziale simile per l’uso come acaricida sistemico. Ciò potrebbe aumentare la flessibilità per l’eventuale progettazione di un prodotto veterinario. Considerando il prezzo, il cloruro di litio e il citrato di litio sono i composti più economici. Il solfato di litio è meno adatto a causa della minore tollerabilità delle api e del carbonato di litio a causa di una solubilità in acqua relativamente bassa.
Per studiare l’efficacia dipendente dalla concentrazione dei composti del litio in modo più dettagliato, abbiamo confrontato LiCl con citrato di litio (Li3C6H5O7), che aveva la maggiore differenza nel numero di ioni di litio per molecola, a cinque diverse concentrazioni in un intervallo di 1 mM-25 mm. Tutte le concentrazioni di citrato di litio hanno mostrato un’attività acaricida significativamente più elevata rispetto a LiCl, ma non vi è stata alcuna differenza nella mortalità delle api (Tabella 3, Tabelle supplementari S9 e S11). Pertanto, il citrato di litio potrebbe rappresentare un principio attivo ancora migliore.
Come al litio-free di controllo e al fine di escludere il cloruro come un agente attivo, abbiamo testato anche sali alcalini di sodio cloruro (NaCl) e cloruro di potassio (KCl) e di cloruro di magnesio (MgCl) a 25 mM. Non abbiamo osservato un varroacidal effetto di NaCl o KCl (n = 3 gabbie, P = 1.000, log-rank test, Tabella Supplementare S12). Nei test con MgCl il 100% delle api in gabbia è morto entro cinque giorni (P < 0.001, log-rank test), e in base al numero in calo di api, l’esperimento è stato terminato prima che l’effetto sugli acari potesse essere analizzato. Sulla base di questi esperimenti, abbiamo concluso che il litio media effettivamente l’attività acaricida in modo dose-dipendente e che il citrato di litio presenta le proprietà più favorevoli di tutti i composti testati finora.
Potenziale dei composti del litio come nuovo varroacide
Abbiamo dimostrato che non gli RNA a doppio filamento inizialmente ipotizzati contro i geni Varroa essenziali ma sorprendentemente i sali di litio mediano un forte effetto acaricida sugli acari Varroa sulle api in gabbia e negli sciami artificiali. Pertanto, questi risultati mostrano che i composti del litio rappresentano una nuova classe di agenti acaricidi con un potenziale eccezionale e una tollerabilità notevolmente buona da parte delle api. La diversa suscettibilità degli acari e delle api al LiCl è ancora più notevole considerando che, a causa degli effetti di diluizione, la concentrazione di LiCl nell’emolinfa delle api sarà probabilmente sostanzialmente inferiore alla concentrazione alimentata alle api.
È importante sottolineare che i nostri risultati non implicano che gli effetti acaricidi degli approcci basati su RNAi pubblicati da Garbian et al.32 sono generalmente mediati da LiCl. Dopo l’alimentazione di una miscela di dsRNA alle api da miele per un periodo di 60 giorni, Garbian et al.32 ha registrato un lento aumento della mortalità degli acari con un’efficacia del trattamento finale di solo il 60%. In considerazione della risposta rapida e altamente efficace dei nostri sciami artificiali ai trattamenti con LiCl, sono probabili diverse modalità di azione: mentre gli effetti mediati da RNAi sembrano esercitare effetti a lungo termine, i composti di litio rappresentano un meccanismo indipendente con insorgenza rapida ed elevata efficacia.
Come varroacide, LiCl visualizza alcune caratteristiche uniche in questa combinazione: (i) LiCl atti sistemica per via delle api da miele di alimentazione (“facile da applicare,”), (ii) è solubile in acqua e quindi non si accumulano in cera d’api che è un problema cruciale per il trattamento a lungo termine concetti utilizzando sintetico varroacides con lipofile properties36,37 (iii) la tossicità orale della maggior parte dei composti di litio per i mammiferi è relativamente low38 (iv) non ha alcun effetto repellente sulla soluzione di alimentazione del relativo intervallo di concentrazione di 2-25 mM39 e (v) è disponibile a prezzi moderati. Molto promettente è il fatto che una singola applicazione di soli 10 µl di LiCl in una soluzione di 25 mm (corrispondente ad un dosaggio di 10,6 µg di LiCl) per singola ape è sufficiente per uccidere gli acari foretici. Una sfida per ulteriori ricerche sarà lo sviluppo di una tecnica di applicazione intelligente per sciami e colonie a grandezza naturale per garantire che tutte le api ricevano la quantità critica del composto attivo.
Attualmente, non sappiamo come LiCl stia uccidendo gli acari della Varroa foretica, e ci sono poche pubblicazioni sull’effetto di LiCl negli insetti40. Nella medicina umana, il litio è stato utilizzato dal 1870 ed è un agente stabilizzante dell’umore indicato per il trattamento di episodi maniacali e come trattamento di mantenimento per il disturbo bipolare41. In considerazione del loro uso terapeutico, i composti del litio e il loro profilo di tossicità sono stati attentamente studiati. Finora, un certo numero di enzimi che agiscono sul metabolismo, sullo sviluppo,sull’ematopoiesi e su altri processi sono stati proposti come potenziali bersagli42, 43. Questi enzimi richiedono ioni metallici e litio esercita la sua attività in modo non competitivo, che molto probabilmente si verifica spostando un catione bivalente. Certo, al momento non abbiamo alcuna indicazione che l’effetto miticida osservato dei composti del litio si basi su una modalità di azione comparabile.
Siamo anche consapevoli del fatto che i nostri risultati rappresentano solo il primo passo verso lo sviluppo di un nuovo prodotto veterinario. I test sul campo nelle colonie a volo libero sono altrettanto necessari quanto l’analisi degli effetti collaterali subletali e a lungo termine sulle api adulte e sulla covata di api da miele e sui possibili problemi di residui nel miele.
Tuttavia, i risultati qui presentati indicano già che il LiCl ha un potenziale come trattamento efficace e facile da applicare per gli sciami artificiali e naturali e in particolare per l’enorme numero di api confezionatrici utilizzate per l’impollinazione negli Stati Uniti11,44. Inoltre, la delucidazione del meccanismo d’azione potrebbe aprire nuove strade per lo sviluppo mirato di prodotti veterinari per combattere gli acari della Varroa.