la Diagnosi di Malattia di Graffiatura di Gatto con il Rilevamento di una Bartonella henselae mediante PCR: uno Studio di Pazienti con Linfonodi ingrossati

DISCUSSIONE

In questo studio, abbiamo utilizzato un efficiente e specifico metodo PCR per rilevare il B. henselae htrA gene nei linfonodi tessuti. Abbiamo scelto di studiare pazienti selezionati sulla base di sintomi clinici compatibili con una diagnosi di CSD. Questo ci ha permesso di determinare il valore diagnostico del test PCR in diversi gruppi di pazienti classificati in base al numero di criteri per CSD in modo da poter prevedere la sensibilità del metodo PCR con pazienti che presentano più o meno (a volte no) criteri CSD. Tale approccio, a nostra conoscenza, non è mai stato utilizzato prima ed è vicino a quello utilizzato da un medico che deve fare una diagnosi per un paziente con linfoadenopatia senza alcuna indicazione eziologica. Rispetto ai criteri diagnostici classici per CSD, l’analisi PCR ha mostrato un’eccellente specificità, poiché non sono stati osservati risultati falsi positivi nel nostro gruppo di controllo. I criteri classici rimangono comunque utili, perché il risultato della PCR può talvolta essere negativo per i pazienti con CSD autentico (7 dei 29 pazienti nel gruppo CSD definito nel nostro studio).

La diagnosi di questa malattia si basa su diversi criteri simili a quelli originariamente descritti da Debré et al. (8). Tuttavia, il test cutaneo intradermico non è più disponibile in diversi paesi e, inoltre, nessuno dei criteri inizialmente utilizzati da Debré et al. sono marcatori eziologici della malattia (8). Pertanto, tra i criteri classici, né una storia di contatto con i gatti né un esame clinico o istologico da solo sono sufficienti per la diagnosi di CSD. Una piccola minoranza di pazienti con graffi di gatto sviluppa CSD e molti casi di possibile adenopatia correlata al CSD possono essere attribuiti ad altre cause. Allo stesso modo, un quadro istologico compatibile con CSD può essere visto in altre condizioni, come la tularemia, la malattia di Nicolas Favre o persino la micobatteriosi. Nuovi criteri che includono la sierologia e la diagnosi di PCR dovrebbero essere utili per la diagnosi di un’infezione dovuta a B. henselae.

Il test sierologico per gli anticorpi di B. henselae è stato il primo test microbiologico disponibile, ma attualmente ha un valore predittivo positivo variabile. È un metodo diagnostico indiretto che può essere negativo nella fase iniziale della malattia. In alcuni studi (7, 11, 28), il valore predittivo positivo del test di immunofluorescenza indiretta per B. henselae è stato segnalato come elevato (≥91,4%). Al contrario, Bergmans et al. (6) e Dupon et al. (10) trovato una mancanza di sensibilità del test sierologico tra i pazienti con CSD.

D’altra parte, sia la sierologia CSD che i test PCR specifici per B. henselae sono stati segnalati come negativi (1, 3, 4, 5, 6, 12, 19, 28) nei casi di CSD autentico e la sensibilità del rilevamento della PCR è spesso inferiore all ‘ 80%. Tra gli studi che hanno testato casi ben definiti di CSD, nessuno ha dimostrato che un test PCR di un campione linfonodale è sufficiente per la diagnosi di CSD. Avidor et al. (4) ha riportato una sensibilità del 100%, utilizzando tre diversi saggi di PCR con tre diversi obiettivi, ma questa non è la pratica corrente nella diagnosi di routine.

Diversi gruppi hanno già valutato il valore diagnostico dell’analisi PCR per CSD (1, 3, 4, 5, 6, 12, 20, 27). Un confronto di questi studi è tuttavia difficile a causa delle differenze nell’obiettivo della PCR, nel tipo di campione e nei criteri utilizzati per definire il CSD. Pertanto, diverse coppie di primer sono state utilizzate per rilevare B. henselae mediante amplificazione PCR(3, 4, 5, 6, 14). Il bersaglio 16S rRNA prima impiegato da Bergmans et al. (5) ha dato sensibilità del 96% tra i pazienti con un risultato positivo del test cutaneo per CSD e del 60% tra i pazienti con un risultato negativo del test cutaneo. In un secondo studio, gli stessi autori (6) hanno rilevato che le sensibilità erano 86,4 e 100% per i pazienti con più di due o più di tre criteri per CSD, rispettivamente. Il gene htrA utilizzato nel nostro studio è stato spesso impiegato per testare campioni clinici tra pazienti con sospetta CSD. Anderson et al. (3) e Goldenberger et al. (12) sensibilità ottenute rispettivamente dell ‘ 84% e del 61%, in modo che il nostro risultato (sensibilità del 76%) sia vicino al migliore per questo obiettivo (3, 4). Un confronto tra gli obiettivi 16S rRNA e htrA ha mostrato una migliore sensibilità del primo (60 contro 43%) (26). Avidor et al. (4) ha confrontato il gene gltA (che codifica la citrato sintasi) con i geni 16S rRNA e htrA e ha trovato i primi due obiettivi più sensibili (100 e 94%, rispettivamente) rispetto alla sequenza htrA (69%). Altri obiettivi di PCR non sono stati testati nel nostro lavoro. Tuttavia, la specificità dei risultati è stata garantita elaborando e amplificando una seconda aliquota per tutti i campioni positivi.

I risultati falsi negativi possono essere spiegati sia da una mancanza di sensibilità, come suggerito dagli studi comparativi di Avidor et al. (4) e Sander et al. (25), o dalla presenza di altre specie di Bartonella in CSD (13, 16, 21). Una scarsa qualità dei campioni clinici senza tessuto linfonodale o campioni prelevati dopo un lungo periodo di terapia antibiotica potrebbe anche spiegare alcuni di questi risultati falsi negativi. Nella maggior parte degli studi, i campioni erano campioni di biopsia linfonodale freschi o pus prelevato dai linfonodi(3, 4, 5, 6). Altri due gruppi hanno utilizzato linfonodi fissi incorporati in paraffina (26, 27) e hanno ottenuto sensibilità del 40-70%, in base al target di amplificazione e ai criteri utilizzati per definire il CSD.

Una diagnosi di CSD deve basarsi sulla presenza di una combinazione di criteri epidemiologici, istologici e batteriologici, poiché nessun singolo criterio può essere considerato il gold standard. I criteri utilizzati per definire la CSD sono quindi di grande importanza per la stima delle sensibilità e delle specificità dei test biologici utilizzati per la sua diagnosi, come è stato sottolineato da diversi autori (6, 26, 27). Anderson et al. (3) e Avidor et al. (4) pazienti selezionati con linfoadenopatia con solo contatto con i gatti come criterio per CSD. Nel nostro studio, questi ultimi criteri hanno classificato erroneamente uno dei nostri pazienti come avente CSD, sebbene il paziente in realtà avesse adenopatia piogenica. La sensibilità del test PCR di Sander e Penno (26) era del 65% utilizzando solo criteri istologici per la definizione del caso e aumentata all ‘ 87% quando sono stati considerati anche i risultati sierologici, illustrando la bassa specificità dei criteri istologici. Nello studio di Scott et al. (27), i pazienti sono stati selezionati perché hanno soddisfatto le condizioni istopatologiche e sono stati quindi analizzati secondo criteri diversi. La sensibilità del test PCR in quel lavoro era del 68% (27). Nel nostro studio, l’evidenza istologica era presente nell ‘ 84% dei pazienti che mostravano criteri classici, ma solo nel 72% dei pazienti quando sono stati utilizzati i criteri avanzati, inclusi i risultati della PCR. Ci sono state manifestazioni istologiche compatibili con CSD in tre pazienti per i quali questa diagnosi non è stata infine mantenuta. Nel nostro studio, abbiamo impiegato criteri clinici, sierologici, epidemiologici e istologici definiti con precisione. I nostri pazienti sono stati selezionati non solo tra quelli con una diagnosi precedentemente stabilita di CSD ma anche tra tutti i pazienti che presentano linfoadenopatia e sono stati suddivisi in diversi gruppi, secondo i criteri diagnostici classici. Questo ci ha permesso di ottenere una buona stima della sensibilità del test PCR.

Goldenberger et al. (12) hanno classificato i loro pazienti in quattro categorie (alcuni CSD, possibili CSD, diagnosi sconosciuta e un gruppo di controllo) e hanno testato campioni vari, non tutti derivati da casi di linfoadenopatia, ottenendo una sensibilità del 61% e una specificità del 100%. Per stimare il valore diagnostico del nostro test, in particolare per i pazienti con CSD incerta, abbiamo preferito concentrarsi ciecamente sui casi di linfoadenopatia e raccogliere i dati in modo prospettico, in modo da definire i diversi gruppi utilizzando i criteri usuali per CSD. Abbiamo quindi determinato il valore diagnostico del rilevamento HTRA PCR di B. henselae come criterio aggiuntivo per CSD e quello dei criteri ampliati che includevano il risultato PCR. Sulla base dei nostri risultati, solo un risultato positivo del test PCR può essere considerato sufficientemente specifico per la diagnosi di CSD, poiché nessun paziente nel gruppo di controllo ha avuto un risultato positivo del test PCR, in contrasto con i risultati della sierologia (tre risultati falsi positivi) e istologia (due risultati falsi positivi).

Adottando un approccio clinico, abbiamo innanzitutto determinato il valore diagnostico dell’analisi PCR per un gruppo di pazienti che soddisfano i criteri classici per la CSD. Per tali pazienti, la diagnosi è generalmente facile da fare. Più interessanti sono i pazienti che non soddisfano tutti i criteri per CSD, per i quali la diagnosi può essere molto difficile e il test PCR di B. henselae è molto utile. Questa situazione è frequente nella pratica clinica: istolopatologia assente o aspecifica, sierologia negativa o contatto con gatti senza alcun graffio, dando diverse combinazioni di criteri. Tuttavia, nei nostri possibili pazienti con CSD che hanno presentato solo uno o nessuno dei criteri classici ma per i quali non è stata possibile mantenere alcuna altra diagnosi, il test B. henselae PCR è risultato positivo in tre casi. Nella misura in cui questi tre pazienti mostravano sempre uno dei criteri classici per la CSD, abbiamo testato il valore diagnostico dei criteri avanzati (almeno due criteri, incluso il risultato della PCR). Utilizzando questi nuovi criteri, è stata stabilita una diagnosi di CSD per un ulteriore 10% dei pazienti. Pertanto, utilizzando il test PCR come criterio aggiuntivo, la sensibilità della diagnosi CSD potrebbe essere migliorata senza alcuna diminuzione della specificità, specialmente per i pazienti con criteri diagnostici incompleti. Nel nostro studio, la rilevazione PCR di B. henselae aveva una specificità del 100%. Pertanto, un’analisi PCR potrebbe essere sufficiente per la diagnosi di CSD in pazienti con linfoadenopatia in presenza di un solo altro criterio diagnostico. È interessante notare che una biopsia linfonodale potrebbe essere evitata perché l’amplificazione della PCR può essere eseguita con campioni di pus prelevati da linfonodi con buona sensibilità (quattro dei cinque campioni di pus del gruppo con CSD definito testato erano PCR positivi) e specificità (i campioni di pus sono stati ottenuti da tre pazienti nel gruppo di controllo e tutti erano PCR negativi). A causa del basso numero di pazienti, questo aspetto dovrebbe essere confermato in ulteriori studi.

Altri metodi diretti per il rilevamento delle infezioni da Bartonella, come la colorazione immunoistochimica o la coltura, sono stati riportati per la diagnosi di CSD. Questi metodi non sono stati utilizzati nel nostro lavoro a causa della loro mancanza di sensibilità e specificità. La cultura sull’agar al cioccolato arricchito con IsoVitaleX è stata fatta nel nostro studio ed è sempre stata negativa.

Per stabilire una diagnosi di CSD in pazienti che presentano linfoadenopatia superficiale in un’area isolata, proponiamo l’uso di un approccio eziologico che consiste nel cercare prima la presenza di DNA di B. henselae mediante analisi PCR. Nel caso della positività della PCR, il CSD può essere mantenuto a causa dell’eccellente specificità. Nel caso di un risultato PCR negativo, la diagnosi potrebbe basarsi sulla presenza di almeno due dei seguenti criteri: (i) sierologia positiva, (ii) istologia compatibile con CSD (granuloma piogenico), o (iii) contatto con i gatti durante i giorni o le settimane precedenti la linfoadenopatia, insieme all’eliminazione di qualsiasi altra causa di ingrossamento dei linfonodi (Fig. 1).