L’industrializzazione è associata con elevati tassi di trasferimento genico orizzontale nel microbioma umano

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Intestino di batteri che vivono in simbiosi con gli esseri umani hanno vissuto alti tassi di trasferimento genico orizzontale (HGT) nel tempo evolutivo, almeno tra gli individui nei paesi industrializzati 1,2. Tuttavia non è chiaro come i tassi di HGT si confrontino con il tipico tempo di permanenza batterica nell’intestino umano e come lo stile di vita dell’ospite umano possa influenzare il tasso di HGT e il tipo di geni trasferiti.

Se la scala temporale di trasferimento è più lenta del tempo di permanenza all’interno dell’ospite, i singoli microbiomi acquisiranno principalmente nuove funzioni attraverso l’acquisizione di nuovi ceppi. Tuttavia, se la velocità di trasferimento è sufficientemente rapida, un microbioma “stabile” in termini di popolazioni batteriche 3-5 potrebbe comunque evolvere in risposta a perturbazioni ambientali specifiche dell’ospite attraverso l’HGT, forse in risposta alla dieta o ai cambiamenti nelle pratiche culturali.

Esempi specifici dimostrano che l’HGT può verificarsi all’interno di un singolo individuo 6-10, specialmente quando c’è una forte selezione per funzioni target come la resistenza agli antibiotici 11-13. Ma quale frazione di specie nel microbioma umano ha acquisito geni da un’altra specie nel loro ospite umano più recente, e come si confronta la scala temporale dell’HGT con la scala temporale della colonizzazione umana? Nel nostro precedente studio 1, ci siamo concentrati su HGT che coinvolgono sequenze con somiglianza superiore al 99% e lunghezza superiore a 500bp. Assumendo un tipico orologio molecolare di ~ 1 SNP / genoma / anno 14 e dimensione del genoma di 106 bp, questi criteri sono coerenti con gli eventi di trasferimento accaduti tra 0 e 10.000 anni fa. Pertanto, per rispondere alla domanda se i ceppi commensali acquisiscano regolarmente nuove funzionalità attraverso l’HGT, sono necessarie stime più precise dei tempi per l’HGT.

Per misurare il tasso di HGT su tempi più brevi, abbiamo confrontato la quantità di trasferimento osservata tra batteri isolati all’interno dello stesso individuo con quella osservata tra batteri di individui diversi. Abbiamo ipotizzato che se la velocità di trasferimento fosse veloce rispetto al tempo di residenza tipico di un lignaggio batterico che colonizza il corpo umano, allora osserveremmo livelli più elevati di trasferimento tra ceppi isolati dallo stesso ospite. In alternativa, se la scala temporale per il trasferimento fosse sufficientemente più lunga di una durata di vita umana, osserveremmo livelli simili tra i batteri indipendentemente dal fatto che siano stati isolati dallo stesso ospite. Per focalizzare la nostra analisi sugli eventi più recenti, abbiamo cercato blocchi di grandi dimensioni (>10kb) di DNA identico al 100%, corrispondenti a eventi HGT avvenuti tra 0 e ~100 anni fa, anche se confermiamo anche i nostri risultati utilizzando elementi mobili più corti con lunghezza superiore a 500bp. In questo studio, ci concentriamo solo sui trasferimenti che si verificano tra specie batteriche, ignorando gli eventi di ricombinazione genica all’interno delle specie.

I genomi isolati di riferimento esistenti 4,15–19 non possono essere utilizzati per testare il trasferimento genico diretto tra due batteri all’interno delle persone, perché quasi tutti questi ceppi sono stati isolati da individui diversi. Inoltre, queste collezioni di riferimento sono state campionate quasi esclusivamente da popolazioni industrializzate e non riflettono la diversità degli stili di vita umani. Pertanto, abbiamo analizzato l’intero genoma di 6.188 isolati batterici appena coltivati utilizzando campioni di feci raccolti da 34 individui in 9 popolazioni umane in tutto il mondo: gli Hadza e Datoga in Tanzania, le popolazioni Beti e Baka in Camerun, gli individui Inuit nell’Artico canadese, gli individui Sami e finlandesi in Finlandia e gli individui di una tribù delle Pianure settentrionali nel Montana e dell’area di Boston negli Stati Uniti; Figura supplementare 1 & Tabella supplementare 1 per una descrizione degli stili di vita). Abbiamo raggruppato i genomi batterici in gruppi di specie in base alla somiglianza genomica (usando la distanza di poltiglia come proxy dell’identità nucleotidica media, vedi Metodi). Questi genomi rappresentano 253 specie batteriche in 6 phyla, raggruppando in 62 generi noti e 54 sconosciuti (Figura 1A & Tabelle supplementari 2 & 3 per i dati di coltura e le statistiche sull’assemblaggio del genoma). Le popolazioni umane campionate avevano diversi background genetici e stili di vita molto diversi, che andavano dalle comunità industrializzate a quelle di cacciatori-raccoglitori. Abbiamo campionato molti isolati batterici di specie diverse all’interno di ogni individuo e abbiamo rilevato migliaia di HGT recenti nei nostri dati genomici: in totale, abbiamo catturato 134.958 elementi mobili su più specie batteriche, sia all’interno che tra le persone. il 57% dei genomi batterici (3556/6188) sono stati coinvolti in almeno un recente evento HGT (Figura 1A), indicando che l’HGT è dilagante nell’intestino umano contemporaneo.

Abbiamo scoperto che le specie batteriche coppie di campionato entro le persone sono più propensi a condividere recentemente trasferito il DNA di una stessa specie paia di polli da due persone diverse (il numero di osservati all’interno di persona HGT eventi è stato confrontato con il numero atteso di eventi in base al numero di persona gli eventi, la correzione per la composizione delle specie e irregolare profondità di campionamento, Figura 1B, p-value < 2.2×10-16, vedi Metodi), e questo segnale è guidato da molte diverse specie batteriche che coprono diversi gruppi tassonomici (Figura 1A & 1B). Questo risultato suggerisce che i tempi per HGT sono brevi. A rigor di termini, non possiamo distinguere tra i trasferimenti che si sono verificati nell’host di origine da quelli che possono essersi verificati nel genitore di un host o persino nel nonno. Tuttavia, è improbabile che una grande frazione dei trasferimenti si sia verificata prima della colonizzazione dell’ospite perché il tasso complessivo di HGT è elevato rispetto al tasso di ereditarietà dei ceppi da un genitore (vedere la discussione in Informazioni supplementari). Questi risultati sono robusti ai particolari della nostra analisi: un aumento della frequenza di HGT all’interno degli individui viene replicato quando si limitano le analisi all’interno di ciascuna delle nostre popolazioni campionate, o quando si considerano i 5.126.962 elementi mobili più grandi di 500bp distribuiti su 98% (6068/6188) dei nostri genomi (p-value < 2.2×10-16) (Figura 1A & Supp Fig. 2 & 3). Insieme, questi risultati suggeriscono che gli HGT si verificano in tempi sufficientemente brevi per rimodellare ampiamente e continuamente le funzioni della comunità intestinale durante la vita di un individuo.

Poiché la frequenza HGT è principalmente determinata dai trasferimenti che si verificano tra organismi strettamente correlati, che tendono a scambiare più geni insieme rispetto alle specie lontanamente correlate, abbiamo studiato la frequenza HGT su una gamma di distanze filogenetiche. Mostriamo che la relazione filogenetica è un forte driver di HGTS nel complesso (specie più strettamente correlate che trasferiscono più geni, test di adattamento del modello a effetti misti lineari,p-value < 2.2×10-16), e che il forte arricchimento per il trasferimento all’interno di individui rispetto a tra individui si verifica su tutte le distanze filogenetiche (Figura 2A), che vale anche se si considerano tutti gli HGT più grandi di 500bp (Figura supplementare 4).

Dopo aver stabilito la rapida scala temporale di HGT, abbiamo poi chiesto quali fattori guidano la frequenza di scambio genico nell’intestino umano. Abbiamo ipotizzato che coppie di specie altamente abbondanti in un dato ecosistema avrebbero una maggiore probabilità di scambio genico rispetto alle coppie che coinvolgono almeno una specie a bassa abbondanza, indipendentemente dalla loro distanza filogenetica, anche se in precedenza abbiamo sostenuto contro un ruolo importante per l’abbondanza nel controllo della frequenza HGT 1. Questa ipotesi non era mai stata testata direttamente perché i set di dati che accoppiavano un campionamento genomico approfondito con stime accurate dell’abbondanza non esistevano ancora. Per testare l’ipotesi dell’abbondanza, abbiamo generato dati metagenomici per i campioni di feci da cui avevamo coltivato isolati batterici e calcolato l’abbondanza media di ogni specie batterica all’interno di ogni persona mappando le letture metagenomiche rispetto ai genomi isolati (vedi Metodi). Abbiamo scoperto che l’abbondanza delle specie è un forte determinante dell’HGT (Linear Mixed Effects model fit test, p-value = 1.4×10-11), indipendente dalla filogenesi (Figura 2B), che viene replicato guardando tutti gli HGT più grandi di 500bp (Figura 5 supplementare). I batteri abbondanti hanno maggiori probabilità di impegnarsi in HGT con altri batteri abbondanti, il che è coerente con i meccanismi canonici dell’HGT (ad esempio coniugazione, trasformazione e trasduzione 20) che coinvolgono il contatto cellula-cellula o l’accesso al DNA libero nell’ambiente.

Poiché l’HGT è guidato dalla distanza filogenetica e dall’abbondanza, e l’abbondanza è simile tra gli individui all’interno di una popolazione ospite 5, abbiamo ipotizzato che la stessa specie batterica intestinale scambierebbe geni tra gli individui. Per testare questa ipotesi, abbiamo confrontato le frequenze HGT per coppie di specie batteriche condivise da un minimo di individui 4 all’interno della nostra coorte USA. Abbiamo scoperto che la frequenza HGT è omogenea tra le persone per la maggior parte delle specie batteriche (la deviazione standard media osservata della frequenza HGT all’interno della persona tra le persone è stata confrontata con la distribuzione prevista utilizzando un test di randomizzazione con 1.000 permutazioni, p-value < 0.001, Figura supplementare 6). Ciò suggerisce che l’insieme del centro dei lignaggi abbondanti ripartiti dagli individui all’interno di una data popolazione rappresenta una rete del centro di scambio del gene che permette ai lignaggi batterici di adattarsi alle pressioni selettive comuni che agiscono nella popolazione ospite.

Abbiamo quindi chiesto se l’architettura degli involucri cellulari contribuisca alle differenze nella frequenza HGT, indipendentemente dalla filogenesi e dall’abbondanza. Abbiamo utilizzato i dati di colorazione Gram di riferimento per ogni specie batterica come proxy dell’architettura della parete cellulare, al fine di separare i batteri monoderm gram-positivi (singola membrana citoplasmatica e uno spesso strato di peptidoglicano) dai batteri diderm gram-negativi (due membrane che circondano uno strato sottile di peptidoglicano). Abbiamo scoperto che i batteri diderm si impegnano più frequentemente negli HGT rispetto ai batteri monoderm, indipendentemente dalla filogenesi e dall’abbondanza (p-value = 1×10-3, Figura 2C), che si osserva anche quando si considerano tutti gli HGT più grandi di 500bp (Figura supplementare 7). È interessante notare che la frequenza HGT tra due batteri diderm era simile alla frequenza HGT tra un monoderma e un batterio diderm, suggerendo che i batteri diderm hanno meccanismi di trasferimento che consentono loro di condividere il materiale del DNA con uno spettro molto più ampio di background genetici.

La transizione da stili di vita non industrializzati a quelli industrializzati è associata a drastici cambiamenti nella diversità e nella composizione del microbioma 21-23. Tuttavia, poco si sa su come queste transizioni di stile di vita hanno influenzato i modelli di scambio genico nel microbioma intestinale umano.

Per verificare se le popolazioni umane con un industrializzati stile di vita sono diversi HGT modelli rispetto a popolazioni che non industrializzati, stili di vita, abbiamo guardato le specie di coppie nel nostro set di dati condivisi dagli individui che vivono negli stati UNITI (Boston) e gli individui che vivono in una delle quattro popolazioni da cui abbiamo la più grande di campionamento di specie batteriche: la Hadza (cacciatori-raccoglitori), i Datoga (pastori), il Beti (agronomi) e Baka (attualmente in fase di transizione da un cacciatore-raccoglitore ad un agricoltore di stile di vita). Per ogni coppia di specie batteriche, abbiamo calcolato la frequenza media di HGT a livello di popolazione umana, osservando blocchi di DNA identici (100%) condivisi che sono più grandi di 500bp. Sorprendentemente, abbiamo trovato che specie le coppie di campionato in NOI industrializzati la popolazione scambiati i geni più frequentemente, rispetto a quando sono non industrializzati popolazioni (il numero di osservati non industrializzato popolazione HGT eventi è stato confrontato con il numero atteso di eventi in base al numero dei paesi industrializzati la popolazione degli eventi, la correzione per la composizione delle specie e irregolare profondità di campionamento, p-value < 2.2×10-16, vedere Metodi) (Figura 3A). Questo effetto vale quando si limita l’analisi a ciascuna popolazione non industrializzata individualmente rispetto agli Stati Uniti (Figura 3B). Presi insieme, questi risultati mostrano per la prima volta che lo stile di vita ospite modella le frequenze di trasferimento genico nel microbioma intestinale umano. Questi risultati suggeriscono anche che la transizione a stili di vita industrializzati ha comportato un drastico aumento dei trasferimenti di geni all’interno del microbioma intestinale, potenzialmente a causa di un aumento delle perturbazioni ambientali alle popolazioni batteriche intestinali.

Abbiamo ragionato che se l’HGT si verifica in tempi molto brevi, il tipo di geni trasferiti dovrebbe riflettere le pressioni selettive uniche associate a diversi host e popolazioni individuali 24. Utilizzando i trasferimenti di geni che coinvolgono coppie di specie trovate sia nella popolazione USA che nei popoli Hadza, Beti o Datoga, abbiamo prima confrontato ampi profili di categoria funzionale e abbiamo scoperto che differivano tra stili di vita (Figura 4A, test di bontà del chi-quadrato, p-values < 0.001).

Avendo dimostrato che esistono ampie differenze funzionali tra i tipi di geni trasferiti in diverse popolazioni, ci siamo concentrati sui geni coinvolti in funzioni che pensavamo possano differire tra le popolazioni, inclusi i geni coinvolti in elementi mobili (fago, plasmide, trasposone), resistenza agli antibiotici e funzioni di degradazione dei carboidrati (CAZyme). Abbiamo scoperto che i batteri intestinali nelle popolazioni industrializzate scambiavano quantità relative più elevate di plasmidi, trasposoni e fagi (Figura 4B, test Z a due proporzioni, valori p corretti < 0.001), coerente con i livelli complessivi più elevati di HGT. Gli individui di Hadza e Beti, che consumano grandi quantità di fibre non digeribili, ospitano batteri intestinali che scambiano i geni di CAZyme a frequenze più elevate rispetto agli individui che vivono negli Stati Uniti (Figura 4B). Frequenze di trasferimento molto elevate di geni di resistenza agli antibiotici sono state trovate anche nei microbiomi intestinali degli individui Datoga. I Datoga sono pastori, allevando principalmente bovini e consumando alti livelli di carne e latticini dai loro animali. Come altri agricoltori pastorali nel nord della Tanzania, somministrano antibiotici alle loro mandrie 25,26. I nostri risultati suggeriscono che queste recenti pratiche agricole hanno rapidamente alterato il panorama del fitness nelle viscere delle persone Datoga e hanno già influenzato i modelli di trasferimenti di geni all’interno dei loro microbiomi. Poiché l’uso di antimicrobici commerciali è ormai diffuso tra le popolazioni di pastori nei paesi in via di sviluppo, effetti simili possono verificarsi in molte popolazioni in tutto il mondo con un impatto più ampio sulla diffusione della resistenza antimicrobica al di fuori della clinica.

Numerosi studi hanno studiato come i cambiamenti nella dieta e gli interventi clinici come i trapianti di microbiota fecale 27,28 influenzano la composizione del microbioma intestinale. Ma dedurre la comprensione meccanicistica dai cambiamenti compositivi è difficile. Il nostro studio rivela che gli HGT all’interno del microbioma intestinale riflettono le pressioni selettive uniche di ciascun ospite umano. Pertanto, i modelli HGT possono essere utilizzati per identificare le forze selettive che agiscono all’interno di ogni individuo e per ottenere una comprensione più meccanicistica di questi eventi. I nostri risultati mostrano anche che i dati di sequenziamento dell’intero genoma forniscono informazioni sulla funzione del microbioma personalizzata a un livello di precisione che gli approcci popolari, come l’amplicone 16S e il sequenziamento metagenomico, non possono raggiungere. Infine, l’alto tasso di HGT nell’intestino umano è probabilmente uno sviluppo recente in risposta allo stile di vita industrializzato, che è stato ulteriormente accompagnato da drastici cambiamenti nella natura dei geni scambiati. Potremmo non apprezzare ancora appieno le conseguenze di questi cambiamenti nella frequenza e nella funzione degli HGT sulla salute umana.