Monitoraggio precoce del trattamento della tubercolosi da parte di Xpert ® MTB / RIF

Ai redattori:

I progressi compiuti per migliorare la capacità di laboratorio per la diagnosi della tubercolosi (TB) hanno portato allo sviluppo di saggi molecolari che stanno ora sostituendo i metodi convenzionali di microscopia e di coltura su larga scala . Sfortunatamente, le attuali tecniche molecolari rilevano sia batteri vivi che morti e un risultato positivo non implica la vitalità del patogeno. Infatti, il DNA può persistere per un lungo periodo dopo la morte batterica e l’acido nucleico da batteri morti è ugualmente amplificabile. Pertanto, i saggi molecolari non sono adatti per il monitoraggio del trattamento e/o per scopi di controllo delle infezioni.

Riportiamo un approccio innovativo per amplificare selettivamente il DNA derivato da Mycobacterium tuberculosis vitale in campioni clinici, che è utile per il monitoraggio del carico micobatterico nei pazienti affetti da tubercolosi polmonare durante il trattamento anti-TB.

Il protocollo si basa sul pretrattamento di campioni con propidium monoazide (PMA; Biotium Inc., Hayward, CA, USA), un composto chimico che può intercalare il DNA di organismi non vitali (o danneggiati dalla membrana) ma è escluso dai batteri vitali. Dopo l’attivazione della luce, la PMA si lega covalentemente al DNA, impedendone l’amplificazione mediante PCR . Dopo l’esposizione alla luce, la PMA non legata non è in grado di interagire ulteriormente con le molecole di DNA.

Il test è stato inizialmente ottimizzato utilizzando campioni di espettorato negativi ai bacilli acido-veloci (AFB) addizionati con micobatteri vivi o morti a diverse concentrazioni. In breve, cellule vive di Mycobacterium fortuitum sono state aggiunte a campioni di espettorato decontaminato di N-acetil-cisteina negativi per AFB mediante microscopia a striscio ad una concentrazione finale di 106 batteri·mL-1. Un’aliquota di questo campione fatto in laboratorio è stata trattata per uccidere a caldo le cellule di M. fortuitum. La soluzione madre di PMA è stata preparata e conservata a -20°C e protetta dall’esposizione alla luce, fino all’uso, come raccomandato dai produttori. PMA è stato aggiunto come pretrattamento ad una concentrazione finale di 500 µM e incubato per 30 min a 4°C al buio, seguito da esposizione alla luce al diodo emettitore di luce blu (LED)-luce attiva (GenIUL, Terrassa, Spagna) per 15 min a temperatura ambiente. Il DNA è stato quindi estratto utilizzando una procedura standard di fenolo cloroformio. Come controllo per valutare l’efficacia della fase di esposizione alla luce, un’aliquota di DNA nudo estratto da una coltura di M. fortuitum è stata trattata con PMA 500 µM precedentemente esposta alla luce LED per 15 min. Il test di linea-sonda commerciale (GenoType® Mycobacterium CM; Hain Lifescience, Nehren, Germania) è stato quindi eseguito al fine di identificare le specie micobatteriche clinicamente rilevanti . Campioni contenenti M vivo. fortuitum ha mostrato un normale profilo di ibridazione su una striscia di nitrocellulosa, mentre i campioni trattati per uccidere i batteri non hanno mostrato alcuna amplificazione, ad eccezione del controllo interno (dati non mostrati). Poiché il DNA nudo trattato con PMA inattivato dalla luce mostrava un normale profilo di ibridazione, la fase di esposizione alla luce era efficiente e la PCR non era ulteriormente inibita dalla PMA residua.

Dopo aver ottimizzato il protocollo per l’inattivazione del DNA derivato da batteri morti, lo abbiamo adattato al test automatico Xpert® MTB / RIF (Cepheid, Sunnyvale, CA, USA). La PCR in tempo reale eseguita da Xpert® MTB/RIF fornisce cicli di soglia (Ct) che possono essere utilizzati per calcolare la differenza nella resa di amplificazione tra campioni con e senza pretrattamento PMA (ΔCt): un ΔCt basso indica la presenza di DNA amplificabile da batteri vivi, mentre un ΔCt alto indica che il DNA bersaglio nel campione ha origine da batteri morti o danneggiati e, quindi, il pretrattamento PMA influisce significativamente sulla sua amplificazione. Per calcolare il valore ΔCt abbiamo considerato la media tra i valori Ct previsti per ogni sonda inclusa nel test Xpert ® MTB / RIF (da A a E) .

Abbiamo testato il protocollo PMA utilizzando il test Xpert® MTB/RIF su una curva di calibrazione Ct di campioni clinici AFB-negativi con micobatteri vivi/uccisi dal calore aggiunti in diversi rapporti. Alti rapporti morti-vivi hanno determinato una differenza massima nei valori ΔCt tra porzioni trattate termicamente e vive con PMA, mentre i campioni contenenti una percentuale simile di batteri uccisi e vivi non potevano essere differenziati l’uno dall’altro mediante l’uso del pretrattamento PMA (dati non mostrati). Dati simili sono stati riportati da Kralik et al. .

Infine, abbiamo testato l’approccio su campioni clinici. nel primo studio di validazione sono stati inclusi 10 pazienti con diagnosi di TBC polmonare attiva (striscio di espettorato positivo e cultura positivo). I campioni sono stati raccolti al momento della diagnosi (t0) e dopo 10-20 giorni di terapia (t1), N-acetil-cisteina decontaminata e processata per coltura liquida MGIT-960 (BD Diagnostic Systems, Sparks, MD, USA) secondo le linee guida internazionali . Tutti i pazienti erano ancora AFB-positivi dalla microscopia dello striscio dell’espettorato a t1. In parallelo, 250 µL di campioni decontaminati sono stati elaborati per l’analisi molecolare mediante test Xpert ® MTB / RIF con e senza pretrattamento PMA. I campioni sono stati quindi elaborati come raccomandato dalle istruzioni del produttore per il test Xpert ® MTB / RIF.

Come mostrato nella figura 1, la PMA non ha influenzato significativamente la resa PCR dei campioni raccolti a t0 (media±sem ΔCt 2,3±0,5), mentre i campioni raccolti durante la terapia a t1 hanno mostrato un ΔCt di 10,5±0,9 dopo il trattamento con PMA (p=0,0003) confermando che la positività dello striscio di espettorato di questi campioni era principalmente dovuta a batteri altamente danneggiati. Inoltre, ΔCt calcolato tra t0 e t1 in campioni non trattati con PMA è risultato troppo basso (ΔCt 2.9±0.9) per apprezzare una reale diminuzione della carica batterica dovuta alla terapia.

Due pazienti valutati “bassi” a t0 da Xpert® hanno mostrato una coltura negativa a t1, mentre tutti gli altri pazienti valutati “medi” o “alti” sono rimasti positivi alla coltura da MGIT. Sebbene non sia possibile valutare un tempo esatto per la positività, abbiamo osservato che le colture da campioni raccolti a t1 sono diventate positive circa 7-10 giorni dopo rispetto alle colture da campioni raccolti a t0, suggerendo una grave riduzione della carica batterica viva.

Tutti i pazienti sono stati trattati e curati con successo alla fine della terapia, e questo è stato coerente con la riduzione dei batteri vivi rilevati dal test PMA.

Come controllo negativo, abbiamo retrospettivamente incluso anche un caso di fallimento del trattamento (AFB positivo e cultura positivo dopo 5 mesi di trattamento standard). In questo caso, il pretrattamento PMA di entrambi i campioni di espettorato decontaminato raccolti a 1 mese e due durante il trattamento non ha influenzato significativamente la resa della PCR (ΔCt ∼2), supportando così l’inefficacia del trattamento anti-TB.

Lo stesso protocollo dovrebbe, in linea di principio, essere compatibile con altri test molecolari approvati dal CE e con test a sonda lineare approvati dall’Organizzazione Mondiale della Sanità per la diagnosi di TBC; sono necessari ulteriori studi per escludere questa possibilità.

Studi precedenti hanno dimostrato la possibilità di utilizzare PMA per distinguere tra micobatteri vivi e morti usando una concentrazione di 25-50 µM. Durante l’impostazione del protocollo, una concentrazione finale di 100 µM ha completamente evitato l’amplificazione del DNA derivato dal M. fortuito ucciso dal calore; è stato osservato uno sfondo debole dovuto all’amplificazione del DNA da M. tuberculosis ucciso dal calore (dati non mostrati). Possiamo ipotizzare che la diversa composizione della parete cellulare influenzi in qualche modo la capacità del PMA di penetrare i micobatteri danneggiati. Infatti, Kralik et al. ha osservato che la riduzione del segnale indotta da PMA tra Mycobacterium avium subsp vivo e morto. paratuberculosis erano più bassi rispetto a quelli trovati per altre specie batteriche. Inoltre, considerando la quantità di detriti che potrebbero potenzialmente sequestrare le molecole di PMA in sputa decontaminata, abbiamo aumentato la concentrazione finale a 500 µM. Ulteriori studi che valutano le differenze di effetto del trattamento PMA su ceppi che mostrano diversa composizione della parete cellulare (ad esempio ceppi di Pechino) e/o in sputa con caratteristiche diverse (ad esempio espettorato contenente sangue) potrebbe chiarire meglio l’utilità di questo test in diversi contesti clinici.

Secondo LØvdal et al. , una piccola percentuale di celle presumed per essere morto o pesantemente ferito non è capace di crescere. La presenza di un piccolo numero di cellule gravemente ferite ma non coltivabili potrebbe spiegare perché abbiamo ancora un segnale positivo nei campioni raccolti a t1 nonostante il pretrattamento PMA. Il pretrattamento PMA non evita il rilevamento di una piccola percentuale di cellule morte (falso positivo per un test di vitalità): il test potrebbe, quindi, sovrastimare micobatteri vitali. Tuttavia, dal punto di vista clinico, questo rappresenterebbe un errore minore rispetto al rischio (molto piccolo per questo test) di sottovalutare i micobatteri vitali.

I nostri dati indicano, per la prima volta, che le tecniche molecolari quantitative combinate con il metodo PMA potrebbero essere un’alternativa alla microscopia diretta e alla coltura per il monitoraggio della risposta precoce al trattamento e per la valutazione preliminare di regimi personalizzati. L’uso di questo test può consentire una valutazione anticipata dell’efficacia del trattamento, mostrando una chiara diminuzione del carico micobatterico vitale. Tuttavia, l’assenza della risposta alla terapia potrebbe anche essere prontamente identificata dal test consentendo un cambiamento del regime e limitando la diffusione dell’infezione e l’ulteriore sviluppo della resistenza .

• ©ERS 2012