Penetranza ridotta, espressività variabile ed eterogeneità genetica dei difetti del setto atriale familiare

Il difetto del setto atriale secondario (ASD) è una malformazione cardiaca congenita comune che rappresenta il 10% delle cardiopatie congenite isolate.12 ASD non corretto può causare sovracircolazione polmonare, sovraccarico del volume del cuore destro e morte prematura. Modelli di embriogenesi cardiaca hanno suggerito che questo difetto è causato da malformazione del setto primum, con conseguente copertura incompleta dell’ostium secundum (fossa ovalis).3 Tuttavia, non sono noti né i meccanismi cellulari né i segnali molecolari che dirigono questi processi.

Alcuni individui con ASD secundum hanno una storia familiare di questo difetto o di altre malformazioni cardiache congenite e il blocco cardiaco coesistente è stato osservato in alcune famiglie di ASD familiari.4 La base genetica, se presente, per queste osservazioni cliniche rimane poco chiara. Sebbene in alcune famiglie sia stata descritta una modalità di ereditarietà autosomica dominante per l’ASD famigliare 4, l’incidenza di ASD nei fratelli 15 e nella progenie 16 degli individui affetti è spesso inferiore a quella prevista per i singoli difetti genici e sono stati postulati anche modelli multifattoriali di ereditarietà.1

Per identificare la base genetica per l’ASD familiare, abbiamo valutato clinicamente e studiato geneticamente tre generi con ASD ereditato come tratto autosomico dominante. Riportiamo un locus di malattia per ASD familiare sulla regione telomerica del cromosoma 5p e dimostriamo che questo disturbo è geneticamente eterogeneo. La penetranza della malattia era incompleta (l’assenza di un fenotipo clinico in individui portatori della mutazione del gene) e alcuni individui geneticamente affetti mostravano altri difetti cardiaci strutturali. Suggeriamo che la penetranza incompleta e l’espressività variabile dell’ASD familiare possano comportare una significativa sottovalutazione della natura ereditabile di questa condizione.

Metodi

Valutazione clinica

Il consenso informato è stato ottenuto da tutti i partecipanti in conformità con il Brigham and Women’s Hospital Committee of the Protection for Human Subjects From Research Risks. I membri della famiglia in tre generi non correlati sono stati valutati dalla storia, revisione delle cartelle cliniche, esame fisico, ECG a 12 derivazioni e ecocardiografia transtoracica bidimensionale con interrogatorio Doppler a flusso di colore in quattro viste standard e sottocostali. Il cateterismo cardiaco e l’ecocardiografia transesofagea erano stati eseguiti in alcuni individui. ASD e altre malformazioni sono state diagnosticate secondo criteri standard; gli aneurismi del setto atriale sono stati diagnosticati secondo criteri precedentemente stabiliti.Sono stati condotti 78 studi clinici senza conoscere il genotipo.

Analisi genetica

Il DNA genomico è stato isolato dai linfociti periferici come descritto in precedenza.9 Sequenze di ripetizione tandem brevi polimorfiche con eterozigosità > 0.7 e quattro o più alleli sono stati scelti da ciascun cromosoma a intervalli ≈30-centimorgan (cM) e amplificati dal DNA genomico dalla reazione a catena della polimerasi. In breve, 100 ng di DNA genomico è stato amplificato in un volume di 10 µL contenente 40 ng di primer oligonucleotide non etichettato, 40 ng di primer etichettato con 32P, 200 mmol/L ciascuno di dATP, dCTP, dGTP e dTTP e Taq polimerasi. I campioni sono stati denaturati per 2 minuti a 95°C, quindi trattati con 35 cicli, compresa la denaturazione a 95°C per 20 secondi, la ricottura del primer a 58°C per 30 secondi e l’estensione del primer a 72°C per 40 secondi. I prodotti amplificati sono stati elettroforesi su gel di sequenziamento al 6% di poliacrilammide e visualizzati mediante autoradiografia.

Le analisi di legame a due punti sono state eseguite utilizzando MLINK (versione 5.1) con frequenze alleliche determinate dai membri della famiglia e un tasso di fenocopia di 0.001. L’analisi multipunto è stata eseguita con LINKAGE. L’eterogeneità genetica per ASD familiare nello studio kindreds è stata valutata mediante l’uso del programma HOMOG.

Risultati

Valutazione clinica

Sono stati valutati clinicamente settanta individui di quattro generazioni di MAR familiari. In nove individui, un secondo ASD era stato precedentemente identificato (Fig 1A e Tabella). La chiusura chirurgica di un ASD era stata eseguita in 7 individui: la chirurgia si è verificata tra i 22 ei 44 anni in 6 individui e all’età di 4 anni in 1 individuo. Secundum ASD è stato documentato all’autopsia nell’individuo IV-12 (all’età di 34 anni) e al cateterismo cardiaco nell’individuo IV-10 (eseguito all’età di 63 anni). Le valutazioni cliniche in altri membri della famiglia hanno dimostrato un aneurisma del setto atriale negli individui V – 1 e VI-7 (Fig 3) e una vena cava superiore sinistra persistente nei singoli V-1 (Fig 3). Una diagnosi ecocardiografica di stenosi aortica valvolare moderata è stata fatta nell’individuo IV-4; l’eziologia della stenosi aortica era limitata dall’entità della calcificazione della valvola e dalle difficoltà tecniche. Tuttavia, data l’età relativamente giovane alla diagnosi (precedentemente diagnosticata all’età di 54 anni), è molto probabile che questo individuo abbia una valvola aortica bicuspide.10 Lo stato clinico dell’individuo III-1 prima della sua morte è sconosciuto.

Diciotto membri di tre generazioni di MBE familiari sono stati valutati clinicamente. Sei individui avevano un secundum ASD (Fig 1B e Tabella). La diagnosi è stata fatta prima dell’età di 5 anni in 4 individui e ha portato alla chiusura chirurgica dell’ASD durante la prima decade di vita. Gli individui III-2 e IV-8 sono stati diagnosticati con un ASD in età adulta e sono stati sottoposti a chiusura chirurgica alle età di 40 e 32 anni, rispettivamente. Quattro individui avevano altri difetti cardiaci strutturali. Un dotto arterioso pervio è stato diagnosticato nell’individuo IV-2 a 6 mesi (legato all’età di 3,5 anni) e nell’individuo V-1 (legato all’età di 5 anni). L’individuo III-3 aveva una valvola aortica bicuspide stenosata e subì la sostituzione della valvola aortica all’età di 56 anni. Una valvola aortica bicuspide è stata diagnosticata in suo figlio (individuo IV-3) all’età di 37 anni.

Ventitré membri di quattro generazioni della famiglia MXP sono stati valutati clinicamente. Otto individui (Fig 1C e Tabella) sono stati precedentemente riconosciuti per avere secundum ASD e conduzione AV prolungata.1112 Un individuo (IV-7) aveva isolato il blocco AV di secondo grado; l’ecocardiografia transesofagea ha dimostrato strutture cardiache normali. Altre anomalie cardiache strutturali riscontrate nei membri della famiglia includevano stenosi aortica subvalvolare (individuo III-3), difetto del setto ventricolare (individui IV-10 e V-1), tetralogia di Fallot (individui IV-8 e IV-12) e atresia polmonare (individuo IV-8). I membri della famiglia affetti nelle generazioni II e III sono stati diagnosticati dopo i 30 anni di età; tuttavia, le malformazioni cardiache nelle generazioni successive sono state riconosciute dall’età di 4 anni.

Analisi genetica

In ogni famiglia, le valutazioni del pedigree hanno suggerito che un tratto autosomico dominante ha causato ASD ereditato e altri difetti cardiaci strutturali. Solo 9 secundum ASD sono stati identificati nel MAR kindred, e penetranza malattia sembrava incompleta. Ad esempio, l’incidenza di ASD nella prole di questi 9 individui affetti era ≈33% ed era inferiore al previsto per un tratto dominante completamente penetrante. Inoltre, il singolo IV – 2 ha fornito un chiaro esempio di nonpenetrance. Anche se questa donna è clinicamente inalterato, un figlio (V-4) aveva un secundum ASD (Fig 2) e un altro (V-1) ha un aneurisma del setto atriale e persistente vena cava superiore sinistra (Fig 3).

Studi di collegamento sono stati eseguiti nella famiglia MAR per definire la posizione cromosomica di una mutazione che causa ASD familiare. Poiché la penetranza della malattia è stata riconosciuta incompleta, gli studi di collegamento iniziali hanno analizzato solo i genotipi di individui con un ASD o individui la cui prole aveva un ASD. Di conseguenza, la penetranza della malattia è stata fissata al 100%. Sono state testate un totale di 125 brevi sequenze polimorfiche di ripetizione in tandem distribuite su tutto il genoma e ≈25% del genoma è stato eliminato prima che il collegamento fosse rilevato su D5S208. Sono stati quindi valutati i collegamenti con loci vicini sul braccio distale del cromosoma 5p. Un logaritmo massimo di 2 punti del punteggio odds (LOD) di 2.83 (θ=0.0) è stato rilevato a D5S406, e un punteggio LOD multipunto massimo di 3.6 è stato ottenuto (Fig 4). Il locus ASD familiare sul cromosoma 5p è stato designato ASD1.

Un aplotipo di malattia nella famiglia MAR è stato costruito dai genotipi di individui con ASD a 13 loci vicino a ASD1 e confrontato con i genotipi di tutti i membri della famiglia (Fig 1A). Gli aplotipi degli individui III-1, IV-3, IV-10 e IV-12 sono stati ricostruiti dagli alleli della prole e dei coniugi. Ventuno individui hanno mostrato l’aplotipo della malattia, inclusi tutti i membri della famiglia MAR con cardiopatia strutturale (9 individui con ASD secundum, 1 con aneurisma del setto atriale, 1 con aneurisma del setto atriale e vena cava superiore sinistra persistente e 1 con stenosi aortica valvolare). L’aplotipo della malattia è stato trovato anche in 1 individuo deceduto (stato clinico prima della morte sconosciuto) e 8 individui clinicamente non affetti. Sulla base di questo aplotipo di malattia, la penetranza di secundum ASD era del 45%; la penetranza per secundum ASD o aneurisma del setto atriale era del 55%.

L’intervallo di malattia definito dagli aplotipi di individui con ASD secundum si estende su una regione di 11 cM tra D5S2088 e D5S807 (Fig 4). Tuttavia, poiché l’aplotipo della malattia è stato identificato in due individui (VI-7 e V-1) con aneurismi del setto atriale, abbiamo ipotizzato che questa condizione patologica potrebbe rappresentare una forma fruste o chiusura spontanea di un ASD non riconosciuto. L’aplotipo del singolo V-1 presenta un evento di ricombinazione che affina l’intervallo di malattia in una regione di 4 cm tra D5S635 e D5S807. Sono stati calcolati anche i punteggi LOD compresi gli individui con aneurismi del setto atriale come colpiti. Questo massimo 2 punti punteggio LOD è 2.83 (θ=0) a D5S208 e il punteggio massimo di LOD multipunto 3.9, che indica le probabilità di ≈8000:1, il gene della malattia in famiglia MAR è geneticamente legata a loci sul cromosoma 5p.

Per determinare se il gene della malattia in famiglia MAR è stato anche responsabile per la ereditari, i disturbi cardiovascolari nelle famiglie MBE e MXP, linkage è stata valutata al ASD1 locus solo in individui con ASD o persone fisiche, la cui prole era un ASD. I punteggi LOD a due punti ottenuti nella famiglia MBE e nella famiglia MXP erano inferiori a -2.0 nell’intervallo tra D5S2088 e D5S630 (Fig 4), indicando che il gene ASD in queste famiglie non è stato mappato al locus ASD1. Il programma HOMOG ha fornito ulteriori prove di eterogeneità, poiché è improbabile che i difetti cardiaci nelle famiglie MBE e MXP siano dovuti a mutazioni in ASD1 sul cromosoma 5p (P<.001, dati non mostrati).

Discussione

Dimostriamo che l’ASD familiare può essere causato da una mutazione genetica sul cromosoma 5p. Questo disturbo è geneticamente eterogeneo e può anche essere causato da difetti in altri geni indefiniti. Oltre all’ASD secundum, le manifestazioni cliniche del gene ASD1 includono altre malformazioni cardiovascolari frequenti; aneurismi del setto atriale, anomalie venose (vena cava superiore sinistra persistente) e malattia della valvola aortica (valvola aortica bicuspide) si verificano in ≈0,5% – 1% della popolazione e potrebbero essersi verificati per caso in alcuni membri della famiglia.781314 Tuttavia, la probabilità di tre anomalie cardiache che si presentano simultaneamente in tre membri della famiglia con il gene ASD1 per caso da solo è molto piccola. Suggeriamo che le mutazioni nei geni ASD familiari causino un ampio spettro di disturbi cardiovascolari congeniti ereditari.

La diversità del fenotipo clinico combinata con salti generazionali ha portato all’ipotesi che l’eziologia della cardiopatia congenita sia multifattoriale e dovuta all’interazione di tratti complessi (poligenici) e fattori ambientali.1 Le tre famiglie qui studiate caratterizzano le difficoltà di valutare la natura ereditabile della cardiopatia congenita. Sebbene le analisi del pedigree (Fig 1) suggerissero che un tratto autosomico dominante segregato in ogni famiglia, questo modello richiede anche penetranza incompleta ed espressività variabile per tenere conto dello stato clinico di tutti i membri della famiglia. L’aplotipo della malattia (Fig 1A) definito dagli studi di collegamento dei membri affetti nella famiglia MAR ha confermato questo modello. Si presume che la penetranza incompleta, la diagnosi imprecisa o il fenotipo dipendente dall’età rappresentino otto individui clinicamente non affetti che portavano l’aplotipo della malattia.

Le tecniche diagnostiche utilizzate in questo studio potrebbero aver contribuito a sottovalutare il fenotipo. Ad esempio, l’ecocardiografia transesofagea è riconosciuta come più sensibile e specifica dell’ecocardiografia transtoracica nell’identificazione delle anomalie del setto atriale, specialmente negli adulti di grandi dimensioni.15 Sebbene l’ecocardiografia transesofagea possa aver aumentato la resa diagnostica per malformazioni sottili come l’aneurisma del setto atriale, è improbabile che abbia cambiato i principali risultati di questo studio. Alternativamente, lo stato clinico degli individui che portano le mutazioni a ASD1 può cambiare. Ad esempio,poiché l’ASD è una delle numerose malformazioni congenite che possono risolversi “spontaneamente”, le valutazioni 816 eseguite dopo la chiusura spontanea assegnerebbero in modo impreciso uno stato non influenzato e quindi contribuirebbero all’impressione di una ridotta penetranza genica. La base per una ridotta penetranza non è stata stabilita, ma questo fenomeno è associato ad altre malformazioni cardiache congenite.1718

Studi genetici in famiglia MAR hanno inoltre indicato che le mutazioni del gene ASD1 hanno rappresentato diverse altre malformazioni cardiovascolari presenti nei membri della famiglia. Anche se secundum ASD era la malformazione cardiaca più comune nella famiglia MAR e altri due generi di studio, dotto arterioso brevetto, difetto del setto ventricolare, aneurisma del setto atriale, vena cava superiore sinistra, tetralogia di Fallot, valvola aortica bicuspide, stenosi aortica valvolare o subvalvolare e anomalie di conduzione AV sono stati osservati anche. Queste famiglie sono rappresentative di altre famiglie con ASD192021222324 familiare in cui ben il 40% degli individui ha avuto ulteriori o altre anomalie cardiache. L’identificazione di un aplotipo comune in individui della famiglia MAR con difetti cardiaci congeniti distinti può indicare che l’espressività variabile di un singolo difetto genetico può spiegare la diversità clinica della cardiopatia congenita in una famiglia. Diverse malformazioni cardiache sono riconosciute in altri disturbi umani monogenici, tra cui la sindrome di Holt-oram25262728 e le microdelezioni del cromosoma 22q11, 29 e si verificano anche nei topi con deficit del recettore X retinoico.30 Sebbene l’espressività variabile non sia una caratteristica prevista dai modelli embriologici classici dello sviluppo cardiaco, le mutazioni monogeniche ereditarie possono chiaramente causare difetti cardiovascolari pleiomorfi.

Sebbene l’ASD non causi alcun evidente effetto deleterio durante lo sviluppo fetale, le conseguenze di questi difetti durante la vita postnatale sono variabili.2 ASD non corretto può portare a sintomi dovuti a sovracircolazione polmonare e sovraccarico del volume del cuore destro. Tuttavia, la chiusura spontanea nei primi anni di vita è stata ben documentata, senza apparenti sequele a lungo termine.816 L’associazione di aneurisma del setto atriale e secundum ASD ha portato al suggerimento che gli aneurismi sono una malformazione congenita del setto 7 che può svolgere un ruolo nella chiusura ASD postnatale.8 Studi genetici in famiglia MAR supportano questa relazione causa-effetto in quanto un aplotipo di malattia identificato in individui con ASD secundum è stato trovato anche in due individui (V-1, V-7) con aneurisma del setto atriale. Studi seriali di questi individui possono aiutare a definire i cambiamenti postnatali nel setto atriale.

I modelli embriologici di secundum ASD hanno enfatizzato lo sviluppo anormale del setto primum, ma poco si sa delle basi molecolari della settazione atriale. Nessun gene candidato ovvio è stato mappato a ASD1, ma è degno di nota che le grandi eliminazioni del cromosoma 5p causano la sindrome di cri-du-chat, una sindrome del gene contiguo occasionalmente associata a cardiopatia congenita.31 Definizione del gene ASD1 può anche aiutare a chiarire la base molecolare per malformazioni cardiache in questa sindrome. L’identificazione di questo e di altri geni ASD familiari dovrebbe fornire nuove intuizioni sui passi importanti nella morfogenesi cardiaca che portano alla settazione atriale.

Il contributo dei difetti del gene ASD familiare all’incidenza delle cardiopatie congenite rimane sconosciuto. Data l’espressione variabile e la bassa penetranza delle mutazioni del gene ASD qui descritte, un individuo che porta uno di questi difetti genetici potrebbe presentarsi come un caso isolato. Quando la storia familiare rivela un disturbo cardiaco congenito in più di un individuo, si raccomandano valutazioni cliniche e genetiche di tutti i membri della famiglia.

Note a piè di pagina