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Le rotture a doppio filamento nel DNA possono devastare le cellule se non riparate. Pertanto, è stato proposto che le estremità dei cromosomi possano essere strutture cap specializzate che non sono riconosciute come rotture a doppio filamento, impedendo così l’arresto del ciclo cellulare, la degradazione e la fusione ricombinazionale (Muller, 1938; McClintock, 1939). Ora sappiamo che i telomeri comprendono le estremità dei cromosomi e sono essenziali per la stabilità del genoma. I telomeri sono composti da ripetizioni tandem testa-coda di una breve sequenza ricca di G; ad esempio, i telomeri umani sono 2-20 kb di (TTAGGG)n ripetizioni. Le estremità del cromosoma non sono smussate e l’estremità 3′ (filo ricco di G) si sporge in un singolo filo che può invadere l’interno del telomero per spostare la sequenza interna ricca di G e formare una struttura a T (Griffith et al., 1999; Cesare et al., 2003; Doksani et al., 2013), proteggendo così le estremità cromosomiche dall’essere riconosciute dalla cellula come rotture a doppio filamento, oltre alla protezione da proteine che legano il telomero.
I cromosomi eucarioti sono duplicati tramite replicazione semiconservativa con un filo principale (sintesi continua per la crescita netta all’estremità 3′ del filo principale nascente) e in ritardo (sintesi discontinua del frammento di Okazaki per la crescita netta all’estremità 5′ del filo di ritardo nascente) come mostrato in Fig. 1. Nella replicazione cromosomica semiconservativa, il breve primer RNA 5 ‘ viene rimosso dal filamento nascente e il divario viene riempito dal DNA che viene legato al DNA nascente adiacente. Tuttavia, alla fine del cromosoma, il divario dopo la rimozione del 5’ primer RNA terminale sul filo in ritardo non può essere riempito, e il cromosoma può diventare più breve con ogni successivo giro di replicazione. Questo è stato definito il problema della replicazione finale (Watson, 1972; Olovnikov, 1973), e la telomerasi aiuta a risolvere questo problema (Greider e Blackburn, 1987; Soudet et al., 2014).
Replicazione del DNA alla fine dei cromosomi. (A) La replicazione del DNA può iniziare all’interno della regione subtelomerica con forcelle di replicazione (frecce verdi) che progrediscono bidirezionalmente lontano dall’origine. Il DNA dei telomeri viene replicato da una forcella di replicazione che passa attraverso questa regione. In ogni pannello, la sintesi del filo nascente principale è indicata da una linea blu con una singola punta di freccia; la sintesi del filo nascente in ritardo è indicata da una linea blu con più punte di freccia. Nella parte superiore di ciascun pannello, la linea rossa indica il segnale visto dalla microscopia di replicazione che ha iniziato e continuato durante la somministrazione del primo impulso (IdU, rosso), e la linea verde tratteggiata indica il segnale visto per l’estensione della replica durante il secondo impulso (CldU, verde). (B) Su alcune molecole di DNA del cromosoma 14q del topo, la replicazione del DNA inizia all’interno del telomero stesso. In pratica, il secondo impulso (verde) spesso non è stato osservato nel telomero. (C) Le funzioni parzialmente sovrapposte delle elicasi BLM e WRN sono utilizzate per risolvere il DNA G-quadruplex (G4) (struttura blu) che può formarsi sul filamento parentale ricco di G dei telomeri. Nelle cellule carenti di elicasi BLM e/o WRN, la progressione del filo principale nascente nel telomero è compromessa; le forcelle di replicazione rallentate sono indicate da frecce rosse. Lo stress di replicazione risultante è accompagnato dall’attivazione delle origini di replicazione dormienti nel sottotelomero. Il fumetto non è disegnato in scala e l’origine di replica subtelomerica raramente utilizzata in C è più vicina al telomero rispetto all’origine subtelomerica in A.
La replica semiconservativa si verifica prima dell’azione della telomerasi. In precedenza si pensava che la replicazione del DNA iniziasse ad un’origine nel DNA cromosomico adiacente alle ripetizioni dei telomeri, con le forcelle di replicazione che si allontanavano bidirezionalmente dall’origine subtelomerica (Fig. 1 A), replicando così il telomero. Tuttavia, rimaneva la domanda se la replicazione del DNA potesse iniziare con una certa frequenza all’interno del telomero stesso (Fig. 1 B). Questa domanda è stata ora risolta in modo affermativo in questo numero da Drosopoulos et al., che ha usato l’analisi a singola molecola del DNA replicato (SMARD; Norio e Schildkraut, 2001). In questo approccio, le cellule replicanti sono etichettate sequenzialmente da due diversi analoghi nucleotidici che vengono successivamente identificati mediante immunofluorescenza. Ad esempio, nella replica bidirezionale, i segnali rossi del primo impulso saranno affiancati a ciascuna estremità da segnali verdi del secondo impulso. Rapporti precedenti utilizzando SMARD avevano concluso che la maggior parte della replicazione inizia a regioni subtelomeriche nel topo e genoma umano e raramente nei telomeri stessi (Sfeir et al., 2009; Drosopoulos et al., 2012). Nel recente studio di Drosopoulos et al. (2015), ibridazione in situ in fluorescenza (FISH) con sonde da telomeri regione permesso la replica modello per essere analizzati per un 320 kb segmento genomico dalla fine del mouse braccio del cromosoma 14q. A causa del tempo (4 h) per il primo (rosso) di impulso, di solito solo red tratti di segnale entro i telomeri sono stati visti, ma dal momento che molte di queste molecole non hanno il segnale rosso si estendono nella regione subtelomerica, può essere comodamente concluso che la replica deve avere iniziato, entro il telomero (Fig. 1 B). Inoltre, alcune molecole avevano segnale rosso nel telomero affiancato da segnale verde, a sostegno di questa conclusione. Sebbene in questi casi ci fosse il segnale verde cromosoma-prossimale, il segnale verde cromosoma-distale è stato visto raramente. Pertanto, sebbene esistano prove limitate per la replicazione bidirezionale originata nel telomero, è molto chiaro che un’origine di replicazione può esistere all’interno del telomero corretto con un fork di replicazione che si estende nel tempo nel sottotelomero. Rimane essere valutato se la replica avvia ad una frequenza relativamente elevata dei telomeri dei cromosomi diverso 14q.
Questi risultati sollevano la questione se l’origine di replicazione del DNA coincide con la semplice ripetizione di sequenza trovato nei telomeri o, invece, se essa coincide con qualche altra sequenza che potrebbe essere inserito all’interno del telomero. Il primo è suggerito da uno studio con estratti privi di cellule di Xenopus che potrebbero assemblare il complesso di pre-replicazione e subire una replicazione del DNA su DNA esogeno contenente ripetizioni esclusivamente telomeriche (Kurth e Gautier, 2010). Conclusioni simili che la replicazione del DNA può iniziare nelle semplici ripetizioni del DNA trovate nei centromeri in cui sono state osservate bolle di replicazione in Drosophila virilis mediante microscopia elettronica sono state raggiunte (Zakian, 1976) e uno studio recente suggerisce che la replicazione del DNA inizia all’interno del DNA alfa-satellite umano (Erliandri et al., 2014).
Le forcelle delle repliche si muovono lentamente attraverso il DNA telomerico (Ivessa et al., 2002; Makovets et al., 2004; Miller et al., 2006; Sfeir et al., 2009) a causa dell’elevata stabilità termica del DNA telomerico ricco di GC e della sua propensione a formare strutture secondarie stabili, come il DNA G-quadruplex (G4), che può porre problemi per la replicazione del DNA (Lopes et al., 2011; Paeschke et al., 2011). Varie elicasi aiutano a risolvere questo problema; ad esempio, l’elicasi Pif1 aiuta a svolgere G4 (Paeschke et al., 2013). La sindrome di Bloom helicase (BLM) e la sindrome di Werner helicase (WRN) sono state anche implicate nell’assistenza alla replicazione dei telomeri: BLM sopprime i telomeri fragili dipendenti dalla replicazione (Sfeir et al., 2009), e WRN sopprime i difetti nella sintesi del filo di ritardo dei telomeri (Crabbe et al., 2004). Drosopoulos et al. (2015) ora riportano che la sintesi principale del filo che inizia all’interno del telomero ha un tasso di progressione più lento nel sottotelomero nelle cellule carenti di BLM come visualizzato da SMARD. Inoltre, vi è stata una maggiore frequenza di inizio della replicazione nel sottotelomero 14q delle cellule con deficit di BLM, originando più vicino al telomero rispetto alle cellule con capacità di BLM. Queste osservazioni suggeriscono che le origini di replicazione dormienti nel sottotelomero 14q possono essere attivate quando la progressione della forcella è impedita nelle cellule carenti di BLM (Fig. 1 C). Drosopoulos et al. (2015) ha anche riscontrato un aumento dell’inizio della replicazione subtelomerica quando la progressione della forcella di replicazione dal telomero è stata ostacolata dall’afidicolina, come mezzo alternativo per attivare le origini dormienti dallo stress di replicazione. Quando le cellule sono state trattate con lo stabilizzatore G4 PhenDC3, la cottura di origine subtelomerica 14q è aumentata ulteriormente nelle cellule carenti di BLM. Collettivamente, i dati suggeriscono un rallentamento della progressione della sintesi del filo principale da un’origine nel telomero 14q (usando il filo parentale ricco di G come modello) quando le strutture G4 non possono essere risolte in cellule carenti di BLM. Come ulteriore supporto per un ruolo dell’elicasi BLM per rimuovere le strutture G4, c’è stato un aumento della colorazione nelle cellule carenti di BLM da parte dell’anticorpo BG4 (Biffi et al., 2013) contro G4 nell’intero genoma e specialmente nei telomeri.
L’elicasi WRN può svolgere G4 in vitro (Fry e Loeb, 1999; Mohaghegh et al., 2001). Quando Drosopoulos et al. (2015) hanno usato SMARD per analizzare la replicazione in cellule doppiamente carenti di BLM e WRN, hanno trovato una marcata diminuzione del segnale di replicazione rossa nei telomeri 14q, suggerendo una sovrapposizione funzionale tra BLM e WRN per quanto riguarda la sintesi del filo principale al largo del filo ricco di G di telomeri. A sostegno di questa conclusione, c’era più colorazione G4 dall’anticorpo BG4 in cellule doppiamente carenti di BLM e WRN che in cellule carenti di solo BLM o solo WRN. Questa è la prima dimostrazione diretta in vivo di un contributo di elicasi BLM e WRN nella risoluzione delle strutture G4, che è particolarmente necessaria per la progressione della sintesi del filo principale che inizia nei telomeri e viene copiata dal filo ricco di G.