The Embryo Project Encyclopedia

Dal 1958 al 1961, Leonard Hayflick e Paul Moorhead negli Stati Unitiha sviluppato un modo in laboratorio per coltivare ceppi di cellule umanecon set completi di cromosomi. In precedenza, gli scienziati non potevanosostenere colture cellulari con cellule che avevano due set completi dicromosomi come normali cellule umane (diploidi). Di conseguenza, gli scienziatistrotto a studiare la biologia cellulare umana perché non c’era una fonte affidabile di cellule che rappresentavano cellule umane diploidi. Nei loro esperimenti, Hayflick e Moorhead hanno creato ceppi duraturi di cellule umane che hanno mantenuto entrambi i set completi di cromosomi. Hanno poi frozesamples dalle culture in modo che le cellule sono rimaste vitali per futureresearch. Hanno anche notato che le cellule potevano dividere solo un certonumero di volte prima che si degradassero e morissero, un fenomeno più tardochiamato limite di Hayflick. L’esperimento di Hayflick e Moorhead ha permesso la ricerca sulla biologia dello sviluppo e sui vaccini che si basavano sui ceppi di humancell.

Hayflick si è specializzata nella coltura di cellule in ambienti controllati. Nel 1958,si unì al Wistar Institute di Filadelfia, in Pennsylvania, un istituto di ricerca che studiava biologia cellulare evirus, su invito del nuovo direttore dell’istituto, HilaryKoprowski. Koprowski ha incaricato Hayflick di creare colture cellulari perutilizzare negli esperimenti di altri ricercatori dell’istituto. Hayflicklater ha ricordato, tuttavia, che ha usato il suo incarico di ricerca come un’opportunità per studiare i metodi e le limitazioni delle colture cellulari. Toassist nella coltura delle cellule, Hayflick ha reclutato il suo collega di Wistar,Paul Moorhead, che ha studiato la struttura e la funzione delle cellule andchromosomes.

La mancanza di longevità delle normali colture cellulari umane inil laboratorio ha limitato la ricerca che gli scienziati potrebbero fare. Con le colture cellulari, gli scienziati coltivano popolazioni di cellule in vetracondizioni controllate per l’uso nella ricerca. I ricercatori in genere coltivano colture cellulari in vetreria o piastre di petri che contengono mezzo di crescita,una soluzione contenente sali disciolti, zuccheri e altri nutrienti cellulari. Durante la prima metà del ventesimo secolo, i ricercatori ipotizzarono che tutte le colture cellulari normali e sane avessero una capacità innata di dividersi indefinitamente sulla base di precedenti scoperte pubblicate dal biologo Alexis Carrel nel 1912 negli Stati Uniti. In pratica, tuttavia, i ricercatori non hanno osservato una divisione infinita nelle cellule normali.Invece, le cellule in coltura alla fine si degradarono e morirono. Gli Scientistiposited che le celle si sono degradate perché avevano esaurito il medium di culturegrowth di tutti i suoi nutrienti o perché i laboratorytechniciavevano mancato di mantenere le condizioni ambientali ideali per la crescita cellulare. Le uniche cellule umane che si dividevano continuamente in ambienti di laboratorio, chiamate linee cellulari immortali, erano cellule derivate da cellule cancerose. Quelle linee cellulari rappresentavano solo alcuni aspetti della biologia cellulare umana.

A metà del ventesimo secolo, medicoi ricercatori non potevano spiegare cosa causasse il cancro e molti scienziati, tra cui Hayflick e Moorhead,ipotizzarono che alcuni virusmight causassero escrescenze cancerose. Sebbene molti microbiologi usassero cellule derivate da linee cellulari cancerose nella ricerca medica, le cellule non erano generalmente utilizzate nello sviluppo di vaccini perché gli scienziati temevano che i vaccini sarebbero stati contaminati da virus che causano il cancro eventualmente contenuti all’interno delle cellule stesse. Inoltre, le cellule delle linee cancerose, a causa della loro costante divisione, erano eteroploidi, il che significa che avevano un numero maggiore o inferiore di cromosomi rispetto alle normali cellule umane, che hanno due serie complete di cromosomi. Le cellule eteroploidi spesso derivavano dalla divisione cellulare continua su molte generazioni di cellule in coltura.

Hayflick e Moorehead hanno prodotto cellule umane che potrebbero essere coltivate per molte generazioni, come le cellule provenienti da linee cellulari cancerose, ma hanno anche preservato il numero diploide di cromosomi delle cellule e ridotto il rischio di virus teorici che causano il cancro. Hanno descritto il loro esperimento in “The Serial Cultivation of Human DiploidCell Strains”, pubblicato nel 1961.

Hayflick e Moorhead cercarono di sviluppare ceppi di cellule umane che potessero essere coltivate per lunghi periodi di tempo in laboratorio, ma conservavano ancora il loro diploidnumero di cromosomi. Hanno ipotizzato che se fossero trapiantati piccoli campioni di cellule umane diploidi da colture già in crescita in un nuovo ambiente di crescita, aumenterebbero notevolmente il numero di cellule diploidi in coltura. Hayflick e Moorhead proposero che il congelamento di piccole quantità di cellule diploidi avrebbe interrotto la crescita e la divisione della cellulosa senza ucciderle. Le celle congelate poterono thenbe immagazzinate fino a che i ricercatori li hanno richiesti, a quel punto couldthaw le celle congelate, ristabilendole ad attività cellulare normale.Hayflick e Moorhead predissero che dopo lo scongelamento, quelle cellule coltivate non sarebbero diventate eteroploidi come le cellule di altre linee e avrebbero mantenuto il loro set diploide di cromosomi.

L’esperimento di Hayflick e Moorhead mirava sia a creare un metodo per la coltivazione di cellule diploidiche umane in laboratorio per un uso di ricerca a lungo termine, sia a determinare se tali ceppi cellulari contribuissero o meno alle crescite cancerose.Hayflick e Moorhead hanno prima coltivato cellule umane in colture di laboratorio, trapiantato piccoli campioni di cellule in nuovi contenitori per coltivare colture cellulari aggiuntive e congelato campioni di cellule da quelle colture per preservare le cellule per ricerche successive. Successivamente, per verificare se le cellule congelate fossero ancora vitali per la ricerca, Hayflick e Moorheadthawed le cellule congelate e hanno tentato di coltivare colture cellulari da loro.Infine, hanno impiantato campioni di quei ceppi di cellule diploidi umane nei tessuti viventi per vedere se hanno portato a escrescenze cancerose.

Per sviluppare ceppi cellulari umani diploidi, Hayflick e Moorhead hanno iniziato a coltivare cellule da 25 diversi tessuti recuperati da feti abortiti. Thosecells è diventato 25 diversi ceppi di cellule umane, chiamato numericamente WI-1through WI-25. Il WI stava per Wistar Institute, dove sono stati sviluppati i cellstrain. Hayflick e Moorhead usavano tessuti fetali perché, più delle cellule adulte, le cellule fetali si sviluppavano più facilmente nelle cellule dei fibroblasti, che sono cellule specializzate che forniscono supporto strutturale alla maggior parte dei tessuti corporei. Le cellule dei fibroblasti erano preferibili per la coltivazione di cellule di laboratorio perché crescevano rapidlyand continuamente in colture cellulari, fornendo un’abbondanza di cellule per la ricerca. Hayflick e Moorhead tagliarono ciascuno dei campioni di tessuto intosmall, sottili scaglie e poi li impiantarono sulla parete interna di bottiglie di vetro piene di terreno di crescita ricco di sostanze nutritive. Hayflick e Moorheadthen hanno disposto le bottiglie tessuto-rivestite di ogni sforzo delle cellule in un warmenvironment per tre giorni, sostituendo regolarmente il rifornimento fresco del witha del medium di crescita, per cominciare coltivare la coltura cellulare.

Hayflick andMoorhead lascia crescere le colture fino a quando le cellule ricoprono l’intera bottiglia di vetro. Ogni campione di cellule fetali è stato quindi suddiviso da un processochiamato sottocultivazione. Durante la subcultivazione, Hayflick e Moorheadremoved un piccolo campione di cellule e impiantato quelle cellule su thewall di una nuova bottiglia di vetro riempita con terreno di crescita, creando una nuova coltura cellulare dello stesso ceppo cellulare. Ogni nuova coltura cellulare ha costituito una nuova generazione di cellule che potrebbe essere a sua volta ulteriormente coltivata con lo stesso metodo, consentendo al numero totale di cellule di crescere in modo esponenziale. Hayflick e Moorhead hanno poi diviso i campioni delle cellule rimanenti in piccole porzioni e li hanno congelati per fermare la crescita delle cellule e fermare ogni ulteriore divisione cellulare.

Hayflick e Moorheadcontinuarono a sottocoltivare le cellule due volte a settimana per circa dieci mesi, aquale punto le colture cellulari smisero di crescere e iniziarono a degradarsi.Hayflick e Moorhead ipotizzarono che le cellule avessero smesso di dividersi a causa di un accumulo di prodotti tossici di crescita cellulare nel mezzo di crescita. Hayflick e Moorhead provato l’introduzione di growthmedium fresco che era esente da tutte le tossine possibili,ma le colture cellulari continuarono a degradare e morire nel corso dei prossimi mesi. Tuttavia, altre colture cellulari poste nello stesso mezzo di crescita non sono degradate e muoiono. I ricercatori hanno concluso che qualcosa sulle cellulestessi stessi, non il loro ambiente, li ha fatti iniziare a deteriorarsi.

Hayflick e Moorhead tentarono successivamente di determinare se le cellule che avevano congelato potessero ancora essere utilizzate per coltivare più colture cellulari. Dopo aver scongelato piccoli campioni di cellule, Hayflick e Moorheadimpiantato le cellule sulle pareti delle bottiglie di vetro. Li hanno ricoltivati nei mezzi di crescita e hanno scoperto che, anche dopocongelamento, le cellule crescevano ancora in nuove culture, che potevano essere sottocoltivate. Indipendentemente dal precedente congelamento o sottocultivazioni, i ricercatori potrebbero utilizzare campioni di colture cellulari umane diploidi per cresceremaggiore colture cellulari umane diploidi. Hayflick e Moorhead avevano creato un ceppo di cellule umane adiploide che poteva essere coltivato in laboratorio culturesnearly indefinitamente.

Hayflick e Moorhead hanno quindi studiato se le cellule coltivate nelle nuove culture fossero diploidi. Durante la scrittura dell’esperimento, hanno detto che erano preoccupati che le cellule non fossero rimaste diploidi perché le avevano cresciute per molte generazioni, il che può portare all’eteroploidia. Utilizzando i microscopi di luce, Hayflick e Moorhead hanno esaminato campioni di cellule durante la metafase della divisione cellulare, quando i cromosomi sono distinti e facilmente visualizzati. Hanno contato il numero di cromosomi in 250cellule individuali per ottenere una stima di quante cellule avevano ancora il numero adiploide di cromosomi. Hayflick e Moorhead hanno stabilito chepiù del 97% delle cellule erano diploidi anche dopo più di ventigenerazioni di subcultivazione. Hayflick e Moorhead hanno concluso cheil loro processo di coltivazione seriale e congelamento delle cellule fetali era un metodo efficace per preservare un ceppo diploide di cellule umane.

Infine,Hayflick e Moorhead dovevano dimostrare che i loro ceppi cellulari non causavano il cancro. Il problema con le linee cellulari immortali create dacellule tumorali era che i ricercatori ipotizzavano che le cellule potessero contenere virus che causano il cancro. Per assicurarsi che i loro ceppi di newcell non causassero il cancro, Hayflick e Moorhead hanno testato il ceppo cellulare WI-25 nei tessuti viventi. Hanno selezionato il WI-25 strainbecause aveva subito il maggior numero di suddivisioni ed era il ceppo più probabilecell per causare il cancro. Pertanto, se così non fosse, è stato probabileche nessuno degli altri ceppi sarebbe neanche.

I ricercatori hanno impiantatocellule dal ceppo cellulare WI-25 nelle buste guancia di cinque livinghamsters. Come gruppo di controllo sperimentale, hanno anche impiantato cinque buste guanciali di altri criceti con cellule derivate da linee cellulari cancerose. All’inizio apparvero noduli, un segno precoce dello sviluppo del cancro, nei sacchetti di controllo di entrambi i set di criceti. Tuttavia, dopo tre settimane, quasi tutti i noduli nei criceti impiantati con le cellule WI-25 erano scomparsi mentre i noduli nei criceti impiantati con le cellule cancerose erano tutti aumentati di dimensioni. Hayflickand Moorhead ha eseguito biopsie dei noduli rimanenti per confermare la loro previsione che le loro cellule subcultivate non hanno causato il cancro.Le biopsie hanno mostrato che i noduli nei criceti impiantati con cellule provenienti da linee cellulari cancerose erano effettivamente cancerosi, mentre i noduli delle cellule WI-25 erano dovuti a infiammazione e sanguinamento nel sito di impianto.

Hayflick e Moorhead hanno anche impiantato un simile cellstrain umano, WI-1, nei tessuti muscolari di cinque pazienti oncologici morenti.Ha anche impiantato cellule da linee cellulari cancerose in altri cinque pazienti oncologici terminali. Come nei criceti, all’inizio i noduli crescononei siti di impianto di entrambi i gruppi. Dopo un paio di giorni, i noduli cellulari WI-1 hanno iniziato a recedere, mentre i noduli si sono moltiplicati inpazienti impiantati con cellule da linee cellulari cancerose. Alla fine di una settimana, quasi tutti i noduli WI-1 erano scomparsi, e Hayflick e Moorhead hanno biopsiato i noduli rimanenti in entrambi i gruppi. I risultati delle biopsie hanno mostrato che i noduli delle cellule cancerose erano cellule eteroploidiche, mentre i noduli WI-1 erano diploidi e non cancerosi. Le scoperte di Hayflick e Moorhead, che pubblicarono nel 1961,dimostrarono che le cellule diploidi umane potevano essere propagate su molte generazioni, come le linee cellulari cancerose, senza diventare eteroploidi o cancerose.

I risultati hanno avuto un impatto immediato e duraturo sulla comprensione della biologia dello sviluppo e della ricerca scientifica. I risultati del loro esperimento disconfirmarono l’ipotesi di Carrel del 1912 che le cellule normali crescevano indefinitamente in coltura, nonostante le osservazioni di colture cellulari che si degradavano nel tempo. Carrel aveva suggerito che thereason che le cellule, in pratica, sembravano deteriorarsi e gli straordinari di età erano dovuti a condizioni di crescita di laboratorio imperfette per le cellule.Carrel ha affermato che in condizioni ideali, le cellule nelle culture potrebberodividere indefinitamente, agendo efficacemente come una linea cellulare immortale.Le scoperte di Hayflick e Moorhead, tuttavia, hanno indicato che gli organismi di invecchiamento avvengono a livello cellulare,un processo chiamato senescenza, e che le cellule potrebbero subire solo un numero limitato di divisioni prima che si degradassero e morissero. Durante il loro esperimento, Hayflick e Moorheadattempted a coltura continua cellule fetali, sostituendo vecchio growthmedium con fresco, mezzo ricco di sostanze nutritive. Tuttavia, hanno scoperto chedopo circa quaranta o sessanta generazioni, le cellule cominciarono a morire piuttostoche si riproducono, un fenomeno in seguito chiamato limite di Hayflick. Questo risultato ha dimostrato che le cellule non potevano crescere indefinitamente in coltura, anche in condizioni ideali.

Il metodo di coltivazione seriale di cellule diploidi umane di Hayflick e Moorhead ha anche aiutato gli scienziati a mantenere un’abbondante scorta di cellule umane diploidi per la ricerca. Secondo i calcoli di Hayflick e Moorhead, un singolo ceppo di cellule umane potrebbe essere subcoltivato abbastanza volte da produrre quasi 20 tonnellate metriche di cellule vitali. Anche se non tecnicamente immortale, che la fornitura sarebbe beclose di inesauribile per scopi di ricerca pratica.

Inoltre, la creazione di cellule umane diploidi vitali ha permesso la ricerca sui vaccini.Poiché Hayflick e Moorhead hanno dimostrato che i loro ceppi di cellule umane non hanno causato il cancro nei criceti o negli esseri umani, questi ceppi potrebbero essere utilizzati per le vaccinazioni senza la minaccia di contaminare il vaccino con un agente che causa il cancro. Successivi ceppi di cellule umane derivati in modo simile, come WI-38, sono diventati la base per i vaccini per le malattie infantilicome la rosolia e la varicella.

Mentre molti ricercatori hanno accolto con favore lo sviluppo di ceppi di cellule umane da parte di Hayflick e Moorhead, alcuni,compresa la Chiesa cattolica, disapprovavano l’uso di materiale fetale abortito nello sviluppo di vaccini per motivi religiosi. Ilvatican in seguito ha dichiarato che si sono opposti al metodo di sviluppo dei vaccini derivati dai tessuti fetali, non all’uso individuale di quei vaccini per prevenire le malattie.

Hayflick e Moorhead dimostrarono non solo che le cellule umane potevano essere coltivate con successo in laboratorio pur mantenendo un numero diploide di cromosomi,ma anche che potevano mantenere le cellule quasi indefinitamenteattraverso la sottocultivazione seriale. Inoltre, il loro esperimento ha posto la base per Hayflick per ulteriori ricerche sul limite della divisione cellulare nella cultura, in seguito chiamato limite di Hayflick. Le scoperte di Hayflick e Moorhead hanno permesso ulteriori esperimenti nello sviluppo della biologia dello sviluppo e del vaccino fornendo abbondanti cellule umane per la ricerca.