塩化リチウムがミツバチの寄生虫Varroaデストラクタを全身作用で効果的に殺す

パイロット研究:RNAiから塩化リチウムへ

パイロット研究では、ダニが出没するミツバチをケージに入れ、潜在的に必須のVarroa遺伝子のdsRNAを含むショ糖シロップを供給した(補足表S1)。 緑色蛍光蛋白質ＧＦＰ（ｄｓｇｆｐｃｔｌ）のコード配列に基づくｄｓｒｎａを含むプレーンスクロースシロップ（未処理）とシロップを対照とした。 GFPは生物発光性のhydrozoanクラゲAequorea victoriaで発現している。 ミツバチやバロアダニのゲノムには相同遺伝子が存在しないため、GFP配列を対照として選択した。 未処理のグループでは、ダニ死亡率は<5％であった。 対照的に、Varroa遺伝子を標的とするdsRNAを含むスクロース溶液を受け取ったミツバチのすべてのダニは、効果的に三日以内に殺された。 しかし、ミツバチにＧＦＰ ｄｓＲＮＡを給餌した対照実験では、ダニに対する同一の効果が観察された（補足図１ ４Ａ）。 S1）。 これらの結果は、提案されたRNAi媒介機構を除外したが、RNAのまだ未知の効果または試験溶液中の他の成分の活性のいずれかを示唆した。 高濃度の塩化リチウム（Ｌｉｃｌ）をｄｓｒｎａの生産に使用し，ｄｓｒｎａとともにミツバチに供給したので，バロアダニに対する活性を試験するために，スクロース溶液中のＬｉｃｌをケージミツバチに供給することを選択した。 驚くべきことに、dsRNA溶液中の計算された濃度に対応する25mMの濃度のLiClは、dsRNAを含む試験物質と同じくらい効果的にダニを殺した。 さらに、LiClを広範な洗浄（洗浄されたdsGFP ctrl）によってdsRNAから大部分除去した後、miticidal活性は、発症の遅延および活性の低下によって示されるように実質的に減 S1）。 これらのデータから，ＲＮＡノックダウンではなくＬｉｃｌがＶａｒｒｏａダニの観察された活性を媒介し，ｖａｒｒｏａｃｉｄｅとしてのＬｉｃｌの可能性を分析することは価値があると結論した。

塩化リチウムの有効濃度

私たちのパイロット研究の一次観測を裏付けるために、我々は堅牢な統計分析のためのLiClの異なる濃度でケージ実験 パイロット試験で有効であることが判明した25mM濃度に加えて、本発明者らは、有効性の低い閾値を決定するために、2mM、4mMおよび10mMの濃度を使用した。 結果は、以前の研究の知見を支持し、ダニ死亡率の実質的な増加（P<0.001、対数ランクテスト、補足表S2）が示された2mMの低いLiCl濃度に対 より高い濃度の１ ０ｍ Ｍおよび２ ５ｍ Ｍの両方が、処置の２日目からダニ死亡率を有意に増強し、実験の終了時に処置されたダニの９ ６％以上の駆除を達成した（ 1a、補足テーブルS2）。 給餌溶液中にLiClを含まない対照実験では、ダニの死亡率は平均9.3％に達し、したがって、異なる環境条件下で未処理のケージミツバチに飼育されたダニの死亡率の範囲内であった33。 これらの結果に基づいて、我々は2mMと25mMの間の濃度範囲でダニの生存率にLiClの明確な効果を確認しました。

ケージに入れられた蜂に塩化リチウム（licl）を供給する。 （ａ）２ｍ Ｍ〜２ ５ｍ Ｍの間の濃度でＬｉｃｌを供給されたケージミツバチに飼育された雌のＶａｒｒｏａダニのＫａｐｌａｎ−Ｍｅｉｅｒ生存曲線（ｎ＝０ｍ Ｍ（対照）、２ｍ Ｍ、４ｍ Ｍ、１ ０ｍ Ｍおよび２ ５ｍ Ｍのための３ ３、９、９、１ ２、およ すべての濃度において、治療群におけるダニの生存は対照と有意に異なっていた（P<0.001、Bonferroni補正による対数ランク試験）。 （ｂ）２ ４時間Ｌｉｃｌ曝露後のケージ化された働き蜂および雌のＶａｒｒｏａダニのＫａｐｌａｎ−Ｍｅｉｅｒ生存曲線（ｎ＝９ケージ）。 治療群におけるダニの生存率は対照群と有意に異なっていた（P<0.001、対数ランクテスト）が、蜂の死亡率に有意な群差はなかった。

これらの実験では、ケージに入れられたミツバチに、処理によってすべてのダニが殺されるまで、数日間 ただし、養蜂の練習の潜在的な使用のために、より短く、定義された処置の期間は望ましいです。 したがって、本発明者らは、２ ５ｍ ＭのＬｉｃｌの最も有効濃度（図１ ０Ａ）を追加の実験を行った（図１ ０Ｂ）。 1a)を24時間投与した後、糖溶液をさらに六日間給餌した。 観測期間の終わりに、92。ダニの9％（n=225ダニ、P<0.001、対数ランクテスト）は、処理されたミツバチに有意な影響を与えることなく殺された（次の段落を参照）。 この結果は、２ ５ｍ Ｍ Ｌｉｃｌの短期給餌でさえ、ダニ個体群を実質的に減少させるのに十分であることを明確に示している。

寄生ダニを殺すために必要なミツバチによるLiClの摂取量を正確に決定するために、12匹の新しく孵化したミツバチに人工的に10μ lのLiCl溶液を4mM-100mM それぞれ1.7μ gおよび4.2μ gのLiClの取り込みに対応する4mMおよび10mM溶液では、効果は未処理の対照と有意に異ならなかった（n=12ダニ、P=1.000、対数ラン しかし、蜂によって消費された10.6μ gのLiClに相当する25mMの単回投与は、48時間以内に100％のフォレティックダニを殺すのに十分であった（図10B）。 2).

塩化リチウム溶液10μ lを4mMから100mMの濃度で個別に供給したミツバチに飼育されたphoretic Varroaダニの死亡率。実験の開始時に一度、彼らは五日間にわたってスクロースシロップを受けました。 各濃度について、一つの蜂と一つのVarroaダニそれぞれと12ケージを分析しました。 ミツバチに25mM以上の濃度を与えた場合、ダニの生存率は対照群と比較して有意に低下した（P<0.001、対数ランク試験）。

働き蜂への影響

働き蜂に対するLiClの忍容性の分析のために、ダニの死亡率を分析するために使用されたテストケージ（図。 さらに、作業蜂の死亡率を記録した。 Miticidal活性を発揮することが示されている2mM、10mMおよび25mM LiClへの暴露後、処理された働き蜂の死亡率は、異なる摂食群内で平均して3-7％の範囲であった。 10mM LiCl群（n=12ケージ、P=0.015、対数ランク試験；補足表S4）を除いて、値は未処理対照群の4％死亡率と有意に異ならなかった。 さらに、私たちのコントロールの死亡率は、毒性試験34でコントロールとして必要な非処理ケージミツバチの死亡率の範囲内であったため、私たちのテス また、Ｌｉｃｌによる２ ４時間の処理は、働き蜂の死亡率に影響を及ぼさなかった（図１）。 1b;n=9ケージ、P=0.308、対数ランク検定）。 ミツバチに対するLiClの良好な忍容性は、単回投与の給餌によっても確認された（ダニの死亡率については、図を参照）。 2)働き蜂の死亡率の有意な増加を誘発しなかった(P=1.000,対数ランクテスト;補足表S5)。

次に、長期暴露に対する応答を調査するために、最後のケージ蜂が死亡するまで、異なる濃度のLiClを連続的に供給した。 ここでは、処理が大幅に未処理のコントロールケージで26日から23日と22日2mMと10mM LiCl、それぞれ（n=60ミツバチ、P=0.024、対数ランクテスト;補足表S6）に新たに孵化した働き蜂の平均寿命を減少させた。 最高濃度の25mM LiClを受けたミツバチでは、寿命は平均して19日に有意に減少した（図10B）。 3a）。

ケージミツバチに塩化リチウムを供給した後のミツバチの死亡率。 (a)慢性LiCl曝露中のケージ化された働き蜂のカプラン-マイヤー生存曲線。 2mM、10mMおよび25mMの濃度のLiCl飼料は、最後の蜂の死までad libitumを供給した（n=6ケージごとに10ミツバチ）。 すべての治療群の生存率は、糖シロップ対照と有意に異なっていた（P<0.01、Bonferroni補正を伴う対数ランク試験）。 （ｂ）２ ４時間Ｌｉｃｌ曝露後のケージ化作業蜂のＫａｐｌａｎ−Ｍｅｉｅｒ生存曲線。 2mM、10mMおよび25mMの濃度でLiClダイエットは、孵化後の最初の24時間ad libitumを供給し、その後、ショ糖シロップ（n=12ケージ10ミツバチそれぞれ）に置き換えました。 すべての治療群の生存率は、糖シロップ対照と有意に異ならなかった（P>0.1、Bonferroni補正を伴う対数ランク試験）。

しかし、LiClは、孵化後最初の24時間liclを給餌し、最後のケージ蜂が死ぬまでショ糖シロップで置き換えた追加の実験によって示されるよ 3b）。 ここでは、孵化したばかりの働き蜂の平均寿命は、22日（10mM）から24日（対照）の範囲であり、治療間に有意差はなかった（n=治療あたり120ミツバチ、p≤0.126、対数ランクテスト、補足表S7）。 ケージミツバチからのこのデータに基づいて、我々も、短期LiCl治療は完全に働き蜂の生存率にほとんど、あるいは全く影響を与えずにVarroaダニの侵入を根絶す 制御された条件下でのケージ試験で得られたこれらの結果は、Varroa治療への新しいアプローチに向けた成功し、有望な第一歩を表しています。 但し、効率および副作用は分野の条件の下で確認されなければなりません。

人工群れの塩化リチウムを用いたフィールドテスト

フィールド条件を近似するために、我々は女王と約20,000ミツバチからなる九ひなのない人工群れで25mMと50mM LiClをテストしました。 これらの濃度は、まだ短い適用時間（25mM）でミツバチによって許容された最高用量を使用してケージミツバチとの以前の実験に基づいて選択されました。 約20,000ミツバチの人工群れ全体を通してスクロースシロップの均一な分布を達成することは困難であったかもしれないので、我々はさらに、各蜂が十分な量のリチウムにさらされていたことを確認するためにLiClの50mM濃度をテストした。 したがって、群れに、２ ５ｍ ＭのＬｉｃｌ（ｎ＝６）または５ ０ｍ Ｍ（ｎ＝３）を含有するスクロースシロップを３日間与え、続いて、Ｐｅｒｉｚｉｎ（登録商標）の局所適用を行った。 有機リン酸クマフォスを有効成分として含むペリジン®は、対照治療として一般的に使用されている非常に効果的なバロアシドである35。 ダニ死亡率は五日間にわたって監視された。 対照処理の前に、２ ５ｍ ＭのＬｉｃｌは、人工群内に存在するダニの約９ ０％を殺した（表１）。 しかし、より高濃度の溶液（50mM）は、この効果を増加させなかった（λ2試験、P=0.953）。 全体として、有効性はケージ試験と比較して幾分低かった。 一つの説明は、最後の個々の蜂がそれぞれの寄生ダニを殺すのに十分な用量を消費するまで、何千ものミツバチのクラスター内のLiClの分布は、より多くの時間 このような20,000匹以上のミツバチの巨大な実体の必要な摂食時間は、さらなる実験で分析されなければならない。

他のリチウム化合物および非リチウム塩の有効性

Varroaダニに対する効果の活性成分としてリチウムを確認するために、我々はリチウ 特に興味深いのは、クエン酸リチウム、三つのリチウムイオン、硫酸リチウムおよび炭酸リチウムを有する化合物であり、LiCl中の一つのリチウムイオンのみに比べて二つのリチウムイオンを有する。 Ｌｉｃｌと比較して有効性と忍容性を分析するために，一つのリチウムイオン（乳酸リチウム，酢酸リチウム）を有する追加の化合物を加えたが，溶解度，化学反応性および価格が異なっていた。 ケージ実験では、すべての化合物が100％のダニを25mMで三（クエン酸リチウムおよび酢酸リチウム）から四日（硫酸リチウム、乳酸リチウムおよび炭酸リチウム）以内に排除した。 また、4-mM試験溶液は、炭酸リチウムを除いて五日以内（クエン酸リチウム、硫酸リチウム、および酢酸リチウム）-七日以内（乳酸リチウム）のフォレティックダニを完全に死滅させた（表2；補足表S8）。

働き蜂の死亡率は、25mM硫酸リチウムと25mM乳酸リチウムを除いて、未処理の対照ミツバチと比較して、いずれの濃度でも有意に増加しなかった（補足表S9）。 これらの実験により、他のリチウム化合物が全身ダニ駆除剤としての使用のための同様の可能性を有することを確認することができた。 これは獣医プロダクトの可能な設計のための柔軟性を高めるかもしれない。 価格を考慮すると、塩化リチウムとクエン酸リチウムが最も安い化合物です。 硫酸リチウムは比較的低い水容解性によるより低い蜂の忍容性および炭酸リチウムがより少なく適しています。

リチウム化合物の濃度依存性の有効性をより詳細に調べるために、liclとクエン酸リチウム（Li3C6H5O7）を1mM-25mMの範囲の五つの異なる濃度で比較した。 クエン酸リチウムのすべての濃度は、LiClと比較して有意に高い殺ダニ活性を示したが、ミツバチの死亡率に差はなかった（表3、補足表S9およびS11）。 従って、クエン酸リチウムはよりよい有効成分を表すかもしれません。

リチウムフリーコントロールとして、活性剤として塩化物を除外するために、アルカリ塩塩化ナトリウム（NaCl）と塩化カリウム（KCl）、また塩化マグネシウム（MgCl）を25mMで試験した。NaClまたはKCl（n=3ケージ、P=1.000、対数ランクテスト、補足表S12）の殺酸性効果は観察されなかった。 MgClを用いた試験では、ケージミツバチの100％が五日以内に死亡した（P<0。001、対数ランクテスト）、ミツバチの数の減少に応じて、実験はダニへの影響を分析することができる前に終了しました。 これらの実験に基づいて、我々は、リチウムは実際に用量依存的に殺ダニ活性を仲介し、クエン酸リチウムは、これまでに試験されたすべての化合物の中で最も有利な特性を示すと結論した。

新しいバロアシドとしてのリチウム化合物の可能性

我々は、必須バロア遺伝子に対する最初に仮説された二本鎖Rnaではなく、驚くほどリチウ これらの結果は，リチウム化合物がミツバチによる優れた可能性と著しく良好な忍容性を有する新しいクラスの殺ダニ剤を表すことを示している。 Liclに対するダニとミツバチの異なる感受性は、希釈効果のために、ミツバチの血リンパ中のLiClの濃度はおそらくミツバチに供給された濃度よりも実質的に低いことを考慮すると、さらに顕著である。重要なことに、我々の知見は、Garbianらによって公開されたRNAiベースのアプローチの殺ダニ効果を意味するものではありません。

重要なことに、我々の知見は、Garbianらによ一般に、Ｌｉｃｌによって媒介される。 ＤｓＲＮＡの混合物を６ ０日間にわたってミツバチに給餌した後、Ｇａｒｂｉａｎ ｅ ｔ ａ ｌ．32では、ダニ死亡率の緩やかな増加が記録され、最終的な治療効果はわずか60％であった。 LiClによる治療に対する私たちの人工群の迅速かつ非常に効果的な応答の観点から、アクションの異なるモードが可能性があります：RNAi媒介効果は、長期的な効果を発揮するように見えるが、リチウム化合物は、迅速な発症と高い有効性を持つ独立したメカニズムを表しています。

varroacideとして、LiClはこの組み合わせでユニークないくつかの機能を表示します: (i)LiClはミツバチの摂食を介して全身的に作用する(“適用しやすい”)、(ii)水溶性であり、したがって蜜蝋に蓄積しないため、親油性を有する合成バロアシドを用いた長期治療の概念にとって重要な問題である36,37(iii)ほ乳類に対するほとんどのリチウム化合物の経口毒性は比較的低い38(iv)2-25mm39の関連濃度範囲内で摂食溶液に忌避効果がない、(v)適度な価格で入手可能である。 非常に有望なのは、個々の蜂あたりの25mM溶液（10.6μ gのLiClの投与量に相当する）に10μ lのLiClのみを1回適用するだけで、防毒性ダニを殺すのに十分であ さらなる研究のための課題は、すべてのミツバチが活性化合物の重要な量を受け取ることを確実にするために、フルサイズの群れとコロニーのためのスマートなアプリケーション技術の開発になります。現在、LiClがphoretic Varroaダニをどのように殺しているかはわかりませんし、昆虫におけるLiClの効果に関する出版物はほとんどありません40。 人間の医学では、リチウムは1870年代から使用されており、躁病の治療や双極性障害の維持治療に使用される気分安定剤である41。 それらの治療的使用を考慮して、リチウム化合物およびそれらの毒性プロファイルは慎重に調査されている。 これまでのところ、代謝、発生、造血および他のプロセスに作用する多くの酵素が潜在的な標的として提案されている42,43。 これらの酵素は金属イオンを必要とし、リチウムは競争力のない方法でその活性を発揮し、これは二価の陽イオンを置換することによって最も可能性が高い。 確かに、我々は現在、リチウム化合物の観察されたmiticidal効果が作用の同等のモードに依存していることを示すものはありません。

私たちはまた、私たちの結果が新しい獣医製品の開発に向けた最初のステップに過ぎないという事実を認識しています。 自由飛行のコロニーの実地試験は大人の蜂および蜂蜜の蜂のひなに対するsublethalおよび長期副作用および蜂蜜の可能な残余問題の分析と同じように必

しかし、ここで提示された結果は、LiClが人工および天然の群れ、特に米国で受粉に使用される膨大な数のパッケージミツバチのための効果的で適用しやすい治療法としての可能性を秘めていることをすでに示している11,44。 さらに、作用機序の解明は、Varroaダニと戦うための獣医製品の標的とされた開発のための新しい道を開くかもしれない。