Xpert®MTB/RIFによる早期結核治療モニタリング

編集者へ：

結核（結核）診断のための実験室能力を向上させるための進歩は、現在、従来の顕微鏡 残念なことに、現在の分子技術は生きている細菌と死んだ細菌の両方を検出し、肯定的な結果は病原体の生存率を意味するものではありません。 確かに、DNAは細菌の死の後に長期間持続することができ、死んだ細菌からの核酸は同様に増幅可能である。 したがって、分子アッセイは、治療モニタリングおよび／または感染制御の目的には不適当である。

我々は、選択的に抗結核治療中に肺結核患者の抗酸菌負荷を監視するために有用である臨床標本における生存可能な結核菌由来のDNAを増幅する革新的なアプローチを報告しています。

このプロトコルは、プロピジウムモノアジド（PMA;Biotium Inc. Ｈａｙｗａｒｄ，Ｃ Ａ，ＵＳＡ）は、生存不可能な（または膜損傷した）生物のＤＮＡをインターカレートすることができるが、生存細菌から除外される化合物である。 光活性化後、PMAはDNAに共有結合し、PCRによる増幅を防止する。 光曝露後、非結合PMAはDNA分子とさらに相互作用することができない。

アッセイは、最初に異なる濃度で死んだまたは生きているマイコバクテリアでスパイク抗酸菌（AFB）陰性痰サンプルを使用して最適化されました。 手短に言えば、生きているMycobacterium fortuitum細胞は106細菌·mL-1の最終濃度で塗抹顕微鏡によってAFBのために陰性のN-アセチルシステイン除染喀痰標本に加えられた。 この実験室で作製した試料のアリコートを処理して，Ｍ．fortuitum細胞を熱殺傷した。 製造業者によって推奨されるように、ＰＭＡ貯蔵溶液を調製し、−２ ０℃で保存し、使用するまで、光曝露から保護した。 ＰＭＡを前処理として５ ０ ０μ Ｍの最終濃度で添加し、暗所で４℃で３ ０分間インキュベートし、続いて青色発光ダイオード（ＬＥＤ）−活性光（Ｇｅｎｉｕｌ，Ｔｅｒｒａｓｓａ，Ｓｐａｉｎ）に室温で１ ５分間露光した。 次に、標準的なフェノールクロロホルム法を用いてDNAを抽出した。 光曝露ステップの有効性を評価するための対照として、Ｍ．ｆｏｒｔｕｉｔｕｍ培養物から抽出された裸のＤＮＡのアリコートを、予めＬＥＤ光に曝露した５ ０ ０μ Ｍ ＰＭＡで１ ５分間処理した。 次に、臨床的に関連する抗酸菌種を同定するために、市販のラインプローブアッセイ（Ｇｅｎｏｔｙｐｅ（登録商標）Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ＣＭ；Ｈａｉｎ Ｌｉｆｅｓｃｉｅｎｃｅ，Ｎｅｈｒｅｎ，Ｇｅｒｍａｎｙ）を実施した。 ライブMを含むサンプル 細菌を殺すために処理されたサンプルは、内部制御（データは示されていない）を除いて、任意の増幅を示さなかったのに対しfortuitumは、ニトロセルロースストリッ 光不活性化ＰＭＡで処理した裸のＤＮＡは正常なハイブリダイゼーションプロファイルを示したので、光曝露ステップは効率的であり、ＰＣＲは残留ＰＭＡによってさらに阻害されなかった。死んだ細菌に由来するＤＮＡの不活性化のためのプロトコルを最適化した後、Ｘｐｅｒｔ（登録商標）ＭＴＢ／ＲＩＦ自動化アッセイ（Ｃｅｐｈｅｉｄ，Ｓｕｎｎｙｖａｌｅ，Ｃ Ａ，ＵＳＡ）に適合させた。＜／ｐ＞＜ｐ＞＜ｐ＞＜ｐ＞＜ｐ＞＜ｐ＞＜ｐ＞＜ｐ＞＜ｐ＞＜ｐ＞＜ｐ＞＜ｐ＞＜ｐ＞＜ｐ＞ Xpert®MTB/RIFによって実行されるリアルタイムPCRは、pma前処理の有無にかかわらずサンプル間の増幅収率の差（Δ Ct）を計算するために使用することができるしきい値サイクル（Ct）を提供する：低いΔ Ctは生きている細菌からの増幅可能なDNAの存在を示し、高いΔ Ctは、サンプル中の標的DNAが死んだまたは損傷した細菌に由来することを示し、したがって、PMA前処理は、その増幅に有意に影響を与える。 Δ Ｃｔ値を計算するために、Ｘｐｅｒｔ（登録商標）ＭＴＢ／ＲＩＦ試験（Ａ〜Ｅ）に含まれる各プローブについて提供されるＣｔ値の間の平均を考慮した。

我々は、異なる比率で添加された熱殺さ/ライブマイコバクテリアとAFB陰性臨床標本のCt検量線上のXpert®MTB/RIFアッセイを使用してPMAプロトコルをテス 高い死滅生存比は、ｐｍａで熱処理された部分と生きた部分との間のΔ Ｃｔ値の最大差をもたらしたが、同様の割合の死滅細菌および生きた細菌を含む試料は、ＰＭＡ前処理の使用によって互いに区別することができなかった（データは示されていない）。 同様のデータがＫｒａｌｉｋらによって報告されている。 .

最後に、我々は臨床標本のアプローチをテストしました。 活動性肺結核（喀痰塗抹陽性および培養陽性）と診断された10人の患者は、最初の検証研究に含まれていた。 試料を、診断時（ｔ０）に収集し、１ ０〜２ ０日の治療後（ｔ１）に、ｎ−アセチル−システインを除染し、ｍｇｉｔ−９ ６ ０液体培養（Ｂ Ｄ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃ Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｓｐａｒｋｓ，ＭＤ，ＵＳＡ）のために国際ガイドラインに従って処理した。 すべての患者はまだT1で喀痰塗抹顕微鏡によってAFB陽性であった。 並行して、250μ lの除染サンプルを、PMA前処理の有無にかかわらず、Xpert（登録商標）MTB/RIFアッセイによる分子分析のために処理した。 次いで、試料を、Ｘｐｅｒｔ（登録商標）ＭＴＢ／ＲＩＦアッセイのための製造業者の説明書によって推奨されるように処理した。

図1に示すように、PMAはt0で収集された標本のPCR収率に有意に影響しなかった（平均±sem Δ Ct2.3±0.5）が、t1で治療中に収集された標本は、PMA処理後10.5±0.9のΔ Ct（p=0.0003）を示し、これらの試料の喀痰塗抹陽性が主に高度に損傷した細菌によるものであることを確認した。 さらに、PMA未処理試料中のt0とt1の間で計算されたΔ Ctは、治療による細菌負荷の実際の減少を理解するには低すぎる（Δ Ct2.9±0.9）ことが判明した。

Xpert®によってt0で”低”と評価された二人の患者はt1で陰性の培養を示したが、”中”または”高”と評価された他のすべての患者はMGITによって培養陽性 陽性までの正確な時間を評価することはできませんが、我々はt1で収集されたサンプルからの培養物は、生きている細菌負荷の重度の減少を示唆し、t0で収集されたサンプルからの培養物と比較して約7-10日後に陽性になったことを観察した。

すべての患者は治療終了時に正常に治療され、治癒され、これはPMAアッセイによって検出された生菌の減少と一致していた。

陰性対照として、治療失敗例（標準治療の5ヶ月後にAFB陽性および培養陽性）も遡及的に含めた。 この場合、1ヶ月で収集された除染喀痰標本と治療中の二つの両方のPMA前処理は、PCR収率（Δ Ct≤2）に有意に影響しなかったため、抗TB治療の無効性を支持し

同じプロトコルは、原則として、結核の診断のために世界保健機関によって承認された他のCE承認の分子試験およびラインプローブアッセイと互換性があるべきであり、この可能性を排除するためにはさらなる研究が必要である。

以前の研究では、PMAを使用して25-50μ mの濃度を使用して生きているマイコバクテリアと死んだマイコバクテリアを区別する可能性が実証されてい プロトコールの設定の間、１ ０ ０μ Ｍの最終濃度は、熱殺傷Ｍ．ｆｏｒｔｕｉｔｕｍ由来のＤＮＡの増幅を完全に回避した；熱殺傷ｍ．ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ由来のＤＮＡの増幅に起因する弱い背景が観察された（データ 我々は、異なる細胞壁組成が何らかの形で損傷したマイコバクテリアに浸透するPMAの能力に影響を与えることを推測することができます。 実際、Ｋｒａｌｉｋ ｅ ｔ ａ ｌ． 生きていると死んだMycobacterium avium subspの間のPMA誘導信号の減少を観察しました。 傍結核症は他の細菌種に比べて低かった。 さらに、汚染除去されたsputa中のPMA分子を隔離する可能性のある破片の量を考慮して、最終濃度を500μ mに増加させました。 異なる細胞壁組成を示す株（例えば、北京株）および/または異なる特性を有するsputaにおけるPMA処理効果の違いを評価するさらなる研究（例えば、北京株） 血containing有喀痰）は、異なる臨床設定におけるこの試験の有用性をよりよく解明することができる。LØvdal et al.によると、

LØvdal et al. 、死んでいるか、または重く傷つけられていると推定される細胞の小さい割合は育ちません。 我々はまだPMA前処理にもかかわらず、t1で収集されたサンプルで陽性シグナルを持っている理由を重く負傷したが、培養不可能である細胞の数が少 PMAの前処理は死んだ細胞の小さい割合の検出を避けません（実行可能性の試金のための偽陽性）: したがって、テストは、実行可能なマイコバクテリアを過大評価する可能性があります。 しかし、臨床的な観点からは、これは実行可能なマイコバクテリアを過小評価するリスク（このテストでは非常に小さい）と比較して軽微なエラーを表

我々のデータは、初めて、pma法と組み合わせた定量的分子技術は、早期治療応答を監視し、パーソナライズされたレジメンの予備的評価のための直接顕微鏡 この試金の使用は重大なマイコバクテリアの負荷の明確な減少を示す処置の効力のより早い評価を可能にすることができます。 但し、療法への応答の不在はまたテストによってすみやかに識別されるかもしれ養生法の変更を許可し、伝染およびそれ以上の抵抗の開発の広がり

• 2ERS2012