molekylär igenkänning genom inducerad passform: hur passar konceptet?

praktiskt taget alla biologiska fenomen beror på ett eller annat sätt på specifikt molekylärt erkännande. I slutet av 19-talet myntade Emil Fischer sin berömda lock-and-key-analogi för att bilda specificiteten av enzymreaktioner, som är en molekylär förutsättning för livet (4). Enzymet ansågs vara en styv mall där substratet måste passa som en nyckel i ett lås. Under åren blev det emellertid uppenbart att en styv passform mellan förformade molekylstrukturer inte kan förklara alla aspekter av enzymkatalys. Till exempel, varför ska ett mindre substrat inte passa in i det aktiva stället för ett enzym utformat för ett större substrat? Eller varför är vissa enzymer mycket selektiva men andra kan rymma flera strukturellt olika substratmolekyler?

det är i detta sammanhang som Daniel Koshland för över 40 år sedan formulerade begreppet inducerad passform (7). För att underlätta den enzymatiska reaktionen i frånvaro av en exakt passform postulerade han att ”substratet kan orsaka en märkbar förändring i det tredimensionella förhållandet mellan aminosyrorna på det aktiva stället” (7). Tanken om en exakt passform behölls från lås-och-nyckelbilden, men det anges uttryckligen att passformen ”inträffar först efter de förändringar som induceras av själva substratet” (betoning original). Konceptet blev snart lärobokskunskap och har sedan dess använts för att förklara alla typer av molekylära igenkänningsprocesser långt bortom enzym-substratreaktioner. Faktum är att strukturell analys av interagerande biomolekyler har etablerat om och om igen att ett komplex och dess fria komponentmolekyler kan skilja sig åt i fina detaljer om strukturen, i uppenbart stöd för erkännande genom inducerad passform. Ett bra fall i punkt tillhandahålls av flera antigen-antikroppskomplex för vilka rumslig anpassning har visats genom högupplöst kristallstrukturanalys (2). Strukturell plasticitet är också uppenbar i andra protein-proteininteraktioner (12).

varför ska man ifrågasätta en hävdvunnen koncept? Min anledning är att den inducerade passformen ofta är för redo för att förklara varför molekyler utan uppenbar strukturell komplementaritet interagerar. Problemet ligger i det ursprungliga antagandet att en gynnsam passform utvecklas först efter initial bindning, vilket ofta tas för bokstavligt. Med tanke på kinetiken och termodynamiken hos en bindningsreaktion är inducerad passform endast möjlig om matchen mellan de interagerande platserna är tillräckligt stark för att ge den initiala komplexa styrkan och livslängden så att inducerad passform sker inom rimlig tid. Jag vill illustrera denna avgörande punkt med en enkel modellberäkning baserad på den termodynamiska cykeln som visas i Fig. 1. Tänk på molekylerna A och B, som kan vara enzym och substrat, antigen och antikropp, hormon och receptor eller något annat par av interagerande molekyler. För enkelhetens skull antar jag också att den inducerade passformen endast sker i molekyl B, som ändras till B* för att bilda det stabila komplexet AB*. (Detta antagande påverkar inte resultatet av beräkningen utan förenklar den matematiska formalismen.) Bindning genom inducerad passform beskrivs genom reaktionerna 1 och 2 i Fig. 1. I reaktion 1 interagerar A och B för att bilda det initiala komplexet AB, vilket är ett löst bundet par molekyler. Exakta och energiskt gynnsamma interaktioner bildas efteråt i reaktion 2, där B tvingas in i konformation B* genom inducerad passform. Energin för att” dra ”och” trycka ” av B in i passande konformation härstammar från den optimerade passformen som uppnåtts i det slutliga komplexet AB*. Den totala bindningskonstanten för komplex AB * är K = K1 kg K2 = k1 kg k2/K–1 kg k2 (se Fig. 1 för definitioner av bindande konstanter och kinetiska hastighetskonstanter).

som ett praktiskt exempel, föreställ dig ett antigen-antikroppskomplex för vilket K typiskt är i storleksordningen 108 M–1. Eftersom reaktion 1 är ogynnsam tar jag K1 att vara 1 M–1, varav det följer att K2 = 108 M–1. Eftersom K2 >> K1 är jämvikten väl på sidan av antigen-antikroppskomplexet AB*. Om till exempel 1 10-6 m 10-6 m antikropp reagerar med 1 10-6 m 10-6 m, är den termodynamiska jämvikten 91% på sidan av antigen-antikroppskomplexet (beräknat från K = 108 M–1 och totalt = totalt = 1 10-6 m 10-6 m, där kvadratkonsoler indikerar koncentration). Den viktiga frågan, som ofta förbises, är hur lång tid det tar att nå denna jämviktskoncentration. Tidskursen beskrivs av

1

2

för att beräkna tiden för att nå jämvikt behöver man rimliga uppskattningar av k1 och k2 (k–1 och k–2 följer från de valda värdena för K1 och K2; se Fig. 1). Bildningshastigheten för ett mycket svagt komplex kan vara var som helst mellan 102 och 106 M–1•s–1. Jag väljer k1 = 104 M–1•s–1; värdet på k1 har emellertid inte mycket effekt på resultatet av beräkningen. Konformationsförändringar i proteiner har halvtider millisekunder, så jag väljer k2 = 102 s–1 (halvtid = 7 ms, från ln2/k2). Motsvarande värden för bakreaktionerna är då k–1 = 104 s–1 och k–2 = 10-6 s-1. Numerisk integration av ekvationerna 1 och 2 för ovanstående hastighetskonstanter och 1 10-6 m 10-6 m startkoncentrationer av antigen och antikropp ger en halvtid för bildandet av antigen-antikroppskomplexet av ~2,5 h. således når jämvikt tar ~1 dag (~10 halv gånger). Anledningen till denna långa reaktionstid är att det instabila antigen-antikroppskomplexet AB, när det väl bildats, endast har en mycket liten chans att genomgå den inducerade passningsövergången till det stabila antigen-antikroppskomplexet AB*. Den inducerade passformen, även om den är termodynamiskt rimlig, är för långsam för att vara meningsfull som en biologisk reaktion.

Konformationsval är ett alternativ till inducerad passform

andra forskare, inklusive mig själv (1, 3, 5, 8, 13, 14) har påpekat att det finns en alternativ mekanism för inducerad passform. Kärnan i konformationsval, beskrivet av reaktionerna 3 och 4 i Fig. 1, är att konformationsförändringen inte antas inträffa efter initial bindning. Detta är ett ganska uppenbart antagande. Ta antigen-antikroppskomplexet AB*. Det dissocierar till fri antikropp A och fritt antigen B * genom reaktion 4. Därför förekommer B * isolerat även om det bara kan vara en kortlivad minoritetskonformation, som snabbt jämviktar med huvudkonformationen B genom reaktion 3. För att beräkna hur lång tid det tar att nå jämviktskoncentrationen av AB * genom konformationsval antar jag att en av tusen molekyler är i konformation B* (K3 = 10-3). Det följer att K4 = 1011 M–1 Sedan den termodynamiska cykeln av Fig. 1 måste vara nöjd enligt K1 ci K2 = K3 ci K4 = K = 108 m-1. Jag antar vidare att konformationsförändringen B B* är lika snabb som den inducerade passformen (k2 = k3 = 100 s–1). Dessutom behöver man ett värde av associeringsgraden för B * med A i reaktion 4. Uppmätta hastighetskonstanter för antigen-antikroppsbindning ligger i intervallet 104-107 M-1 * s–1 (8, 9, 11). Jag väljer ett medelvärde på k4 = 106 M–1•s–1. Under dessa förhållanden har bildningen av antigen-antikroppskomplexet AB* genom reaktionerna 3 och 4 en halvtid på endast 80 s; jämviktskoncentrationen av AB* uppnås i <15 min.

dessa beräkningar visar att bindning genom inducerad passform endast är meningsfull om det finns en viss utsträckning av redan existerande komplementaritet mellan de interagerande arterna; annars är den ursprungliga komplexa AB för kortlivad (ett antagande implicit i Koshlands första papper). Genom att använda ovanstående terminskonstanter K1 och k2 och 1 10-6 m 10-6 m initiala koncentrationer, finner man att K1 måste vara ~104 M–1 för att uppnå samma halvtid på 80 s för den inducerade passningsvägen som för den konformationella urvalsvägen.

experimentell demonstration av bindning genom konformationsval

överraskande få studier har försökt visa konformationsval trots att det lättare demonstreras än inducerad passform (1, 5, 8, 15). För att visa inducerad passform måste man ta prov strukturell information under bindningsreaktionen, en ganska svår uppgift. För att demonstrera konformationsval måste man visa att bildningshastigheten för komplexet AB* är linjärt proportionell mot koncentrationen av den passande konformatorn B* och olinjärt proportionell mot den totala koncentrationen av B + B*. Om man kan mäta konformationsjämviktsreaktionen 3 i frånvaro av bindningspartnern A, kan man beräkna koncentrationen av B* och förutsäga den totala hastigheten för bildandet av AB*.

ett väl studerat exempel är reaktionen av det enkelkedjiga antikroppsfragmentet riktat mot den 33-restlånga prolininnehållande peptiden GCN4-7P14P, kallad peptid P för kort (6). Peptiden är mycket lik i följd till leucin dragkedja domän av jäst transkriptionsaktivator GCN4, förutom att det inte bildar en leucin dragkedja eftersom den innehåller två prolin rester. (Proliner är inte kompatibla med den spiralformade konformationen av en leucin dragkedja, som är en dimer av spiraler lindade runt varandra.) Antikroppen korsreagerar emellertid med gcn4 leucin dragkedja, och denna korsreaktion följer tydligt en konformationsvalväg. Antikroppen reagerar med den utfällda peptiden, som tillförs från den vikta leucin-dragkedjan (reaktion 3). Jämförelse av den ursprungliga reaktionen av antikroppen med peptid P till korsreaktionen med leucin dragkedja GCN4, förväntar man sig att korsreaktionen är långsammare eftersom antikroppen måste välja en liten mängd ovikt peptid i jämvikt med en stor mängd vikta leucin dragkedja. Dessutom kommer korsreaktionshastigheten med den övervägande vikta leucin-dragkedjan att visa ett olinjärt beroende av den totala antigenkoncentrationen, men ändå ett linjärt beroende av koncentrationen av den lilla mängden ovikt peptid (8, 15). Detta skulle inte vara fallet för en inducerad fit-mekanism, som bör vara bifasisk, med den första fasen som motsvarar en bimolekylär associeringsreaktion vars hastighet beror linjärt på den totala antigenkoncentrationen och den andra fasen till en koncentrationsoberoende konformationell omläggning. Figur 2 visar de faktiska uppgifterna. Graden av bildning av antigen-antikroppskomplexet beror linjärt på koncentrationen av den lilla mängden oveckad peptid och olinjärt på den totala antigenkoncentrationen (Fig. 2A). Figur 2B visar de kinetiska spåren av den snabbare reaktionen med det ursprungliga antigenet och den långsammare reaktionen med gcn4 leucin dragkedja. Icke desto mindre är konformationellt urval av den utfällda leucin-dragkedjan fortfarande storleksordningar snabbare än en inducerad passningsväg eftersom bindning av antikroppen till den vikta leucin-dragkedjan (reaktion 1 i Fig. 1) är extremt svag (1).

energilandskapsmodellen för proteinkonformation

vikta proteiner har inte en enda unik struktur utan betraktas bättre som en stor ensemble av liknande strukturer med liknande energiinnehåll. Dessa så kallade konformatorer är i snabb fluktuation med varandra (10). Om energilandskapet är smidigt växlar de många konformarna snabbt. Om det är robust, ensemblen kan innehålla konformatorer som kan vara helt annorlunda och utbyta långsammare. Således är valet mellan strukturerna B och B* en grovt förenklad vy. I verkligheten är det mer som ett urval bland mycket många mer eller mindre passande strukturer (13). Slutresultatet av konformationsval är dock detsamma: de konformatorer som visar den bästa passformen binder bäst.

slutsatser

Konformationsval är ett värdefullt alternativ till inducerad passform. Detta är inte att säga att bindning genom inducerad passform inte uppstår. Egentligen verkar en kombination av konformationsval och inducerad passform vara den bästa beskrivningen av interaktionen mellan molekyler som uppenbarligen inte passar optimalt till att börja med. Vi kan föreställa oss val mellan delvis passande strukturer följt av mindre omjusteringar till det slutliga stabila komplexet (som enligt landskapsteorin i sig är en ensemble av liknande konformatorer). Huvudpoängen är att inducerad passform inte kan vara ett botemedel som ofta påstås i litteraturen. Inducerad passform kräver viss tidigare molekylär matchning för att ge tillräcklig affinitet före konformationell anpassning. Om detta villkor inte är uppfyllt leder inducerad passform till en kinetisk flaskhals, även om den totala reaktionen är termodynamiskt genomförbar.