moleculaire herkenning door geïnduceerde Fit: hoe geschikt is het Concept?

vrijwel alle biologische verschijnselen hangen op de een of andere manier af van specifieke moleculaire herkenning. Aan het einde van de 19e eeuw bedacht Emil Fischer zijn beroemde lock-and-key analogie om de specificiteit van enzymreacties in beeld te brengen, die een moleculaire premisse van het leven zijn (4). Het enzym werd beschouwd als een stijve sjabloon waarin het substraat moest passen als een sleutel in een slot. Door de jaren heen werd het echter duidelijk dat een stijve pasvorm tussen voorgevormde moleculaire structuren niet alle aspecten van enzymkatalyse kan verklaren. Bijvoorbeeld, waarom zou een kleiner substraat niet passen in de actieve plaats van een enzym ontworpen voor een groter substraat? Of waarom zijn sommige enzymen zeer selectief, maar andere kunnen verschillende structureel verschillende substraatmoleculen bevatten?in deze context formuleerde Daniel Koshland meer dan 40 jaar geleden het concept van de geïnduceerde fit (7). Om de enzymatische reactie te vergemakkelijken bij afwezigheid van een precieze pasvorm, stelde hij dat “het substraat een merkbare verandering kan veroorzaken in de driedimensionale relatie van de aminozuren op de actieve plaats” (7). Het idee van een precieze pasvorm werd behouden uit de lock-and-key afbeelding, maar er werd expliciet gesteld dat de pasvorm “pas optreedt na de veranderingen veroorzaakt door het substraat zelf” (nadruk origineel). Het concept werd al snel leerboekkennis en is sindsdien gebruikt om allerlei moleculaire herkenningsprocessen te verklaren die veel verder gaan dan enzym-substraatreacties. Inderdaad, heeft de structurele analyse van op elkaar in wisselwerking staande biomoleculen keer op keer vastgesteld dat complexe en zijn vrije componentmolecules in fijne details van structuur, in duidelijke steun van erkenning door veroorzaakte pasvorm kunnen verschillen. Een goed geval in punt wordt verstrekt door verscheidene antigeen-antilichaamcomplexen waarvoor ruimtelijke aanpassing door analyse van de kristalstructuur met hoge resolutie is aangetoond (2). Structurele plasticiteit is ook duidelijk in andere eiwit-eiwitinteracties (12).

waarom zou één vraag een aloude concept moeten zijn? Mijn reden is dat de geïnduceerde fit paragon vaak te klaar bij de hand is om te verklaren waarom moleculen zonder zichtbare structurele complementariteit interageren. Het probleem ligt in de oorspronkelijke veronderstelling dat een gunstige pasvorm zich pas ontwikkelt na de eerste binding, die vaak te letterlijk wordt genomen. Gezien de kinetiek en thermodynamica van een bindingsreactie is geïnduceerde fit alleen mogelijk als de match tussen de interagerende plaatsen sterk genoeg is om de initiële complexe voldoende sterkte en levensduur te bieden zodat geïnduceerde fit binnen een redelijke tijd plaatsvindt. Ik wil dit cruciale punt illustreren met een eenvoudige modelberekening op basis van de thermodynamische cyclus zoals weergegeven in Fig. 1. Overweeg molecules A en B, die enzym en substraat, antigeen en antilichaam, hormoon en receptor, of een ander paar op elkaar inwerkende molecules kunnen zijn. Ter wille van de eenvoud ga ik er ook van uit dat de geïnduceerde pasvorm alleen voorkomt in molecuul B, dat wordt omgezet in B* om het stabiele complex AB*te vormen. (Deze aanname heeft geen invloed op het resultaat van de berekening, maar vereenvoudigt het wiskundige formalisme.) Binding door geïnduceerde pasvorm wordt beschreven door Reacties 1 en 2 van Fig. 1. In reactie 1, A en B interageren om het aanvankelijke complexe AB te vormen, dat een losjes gebonden paar molecules is. Precieze en energetisch gunstige interacties vormen zich daarna in reactie 2, waarbij B wordt gedwongen tot conformatie B* door geà nduceerde fit. De energie voor het ” trekken “en” duwen ” van B in de montageconstructie komt voort uit de geoptimaliseerde pasvorm die in het uiteindelijke complex AB*wordt bereikt. De totale bindingsconstante voor complex AB * is K = K1 × K2 = k1 × k2/k–1 × k–2 (zie Fig. 1 Voor definities van bindingsconstanten en kinetische snelheidsconstanten).

zie als praktisch voorbeeld een antigeen-antilichaamcomplex waarvoor K doorgaans in de orde van 108 M–1 ligt. Omdat reactie 1 ongunstig is, neem ik K1 aan als 1 M-1, waaruit volgt dat K2 = 108 M-1. Omdat K2 >> K1, bevindt het evenwicht zich goed aan de kant van het antigeen-antilichaamcomplex AB*. Als bijvoorbeeld 1 × 10-6 m antilichaam reageert met 1 × 10-6 m antigeen, is het thermodynamische evenwicht 91% aan de zijkant van het antigeen-antilichaam complex (berekend uit K = 108 M–1 en totaal = totaal = 1 × 10-6 M, waarbij vierkante haakjes de concentratie aangeven). De belangrijke vraag, die vaak over het hoofd wordt gezien, is hoe lang het zal duren om deze evenwichtsconcentratie te bereiken. Het tijdsverloop wordt beschreven door

1

2

om de tijd te berekenen om een evenwicht te bereiken, moet men redelijke schattingen van k1 en k2 (K–1 en k–2 volgen uit de gekozen waarden van K1 en K2; zie Fig. 1). De vormingssnelheid van een zeer zwak complex kan ergens tussen 102 en 106 M–1•s–1 liggen. Ik kies k1 = 104 M-1•s – 1; de waarde van k1 heeft echter niet veel effect op het resultaat van de berekening. Conformationele veranderingen in eiwitten hebben halve tijden van milliseconden, dus kies ik k2 = 102 s-1 (rusttijd = 7 ms, van ln2/k2). De overeenkomstige waarden van de rugreacties zijn dan k – 1 = 104 s – 1 en k–2 = 10-6 s–1. Numerieke integratie van vergelijkingen 1 en 2 voor de bovengenoemde snelheidsconstanten en 1 × 10-6 m beginconcentraties van antigeen en antilichaam geeft een rusttijd voor de vorming van het antigeen-antilichaam complex van ~ 2,5 uur. aldus bereikt evenwicht duurt ~1 dag (~10 halve tijden). De reden voor deze lange reactietijd is dat, eenmaal gevormd, het onstabiele antigeen-antilichaamcomplex AB slechts een zeer kleine kans heeft om de geïnduceerde fit-overgang naar het stabiele antigeen-antilichaamcomplex AB*te ondergaan. De geïnduceerde pasvorm, hoewel thermodynamisch redelijk, is te traag om zinvol te zijn als een biologische reactie.

conformationele selectie is een alternatief voor geïnduceerde fit

andere onderzoekers, waaronder ikzelf (1, 3, 5, 8, 13, 14) hebben erop gewezen dat er een alternatief mechanisme voor geïnduceerde fit. De essentie van conformationele selectie, beschreven door Reacties 3 en 4 van Fig. 1, is dat de bevleeswijziging niet wordt verondersteld te gebeuren na de initiële binding. Dit is een nogal voor de hand liggende veronderstelling. Neem het antigeen-antilichaamcomplex AB*. Het dissocieert in vrij antilichaam A en vrij antigeen B * door reactie 4. Vandaar dat B* in afzondering voorkomt, ook al kan het slechts een kortstondige minderheidsvorm zijn, die snel equilibrerend is met de grote bouwvorm B door reactie 3. Om te berekenen hoe lang het duurt om de evenwichtsconcentratie van AB* te bereiken door conformationele selectie, neem ik aan dat één op de duizend moleculen in conformatie B* (K3 = 10-3) is. Hieruit volgt dat K4 = 1011 M–1 sinds de thermodynamische cyclus van Fig. Aan 1 moet worden voldaan overeenkomstig K1 × K2 = K3 × K4 = K = 108 M-1. Verder ga ik ervan uit dat de conformationele verandering B → B* even snel is als de geïnduceerde fit (k2 = K3 = 100 s–1). Bovendien heeft men in reactie 4 een waarde nodig van de mate van associatie van B* met A. De gemeten snelheidsconstanten voor antigeen-antilichaambinding liggen tussen 104-107 M-1 * s–1 (8, 9, 11). Ik kies een middelste waarde van K4 = 106 M–1•s-1. Onder deze omstandigheden heeft de vorming van het antigeen-antilichaamcomplex AB* via reacties 3 en 4 een rusttijd van slechts 80 s; de evenwichtsconcentratie van AB* wordt bereikt in <15 min.

deze berekeningen tonen aan dat binding door geïnduceerde fit alleen zinvol is als er een zekere mate van reeds bestaande complementariteit tussen de op elkaar inwerkende soorten is; anders is het initiële complex AB te kortstondig (een aanname impliciet in Koshland ‘ s initiële paper). Door gebruik te maken van de bovenstaande forward rate constanten k1 en k2 en 1 × 10-6 m initiële concentraties, vindt men dat K1 ~104 m–1 moet zijn om dezelfde halftijd van 80 s te bereiken voor de geïnduceerde fit pathway als voor de conformationele selectie pathway.

experimenteel aantonen van binding door conformationele selectie

verrassend weinig studies hebben geprobeerd conformationele selectie aan te tonen, ondanks het feit dat dit gemakkelijker kan worden aangetoond dan geïnduceerde pasvorm (1, 5, 8, 15). Om geïnduceerde pasvorm aan te tonen, zou men structurele informatie moeten bemonsteren in de loop van de bindende reactie, een nogal moeilijke taak. Om conformationele selectie aan te tonen, moet worden aangetoond dat de vormingssnelheid van het complex AB* lineair evenredig is met de concentratie van de fitting conformer B* en niet lineair evenredig met de totale concentratie van B + B*. Als men in afwezigheid van bindingspartner A de conformationele evenwichtsreactie 3 kan meten, kan men de concentratie van B * berekenen en de totale snelheid van de vorming van AB * voorspellen.

een goed bestudeerd voorbeeld is de reactie van het eenketenantilichaam-fragment gericht tegen het 33-residu-lange proline-bevattende peptide GCN4-7P14P, kortweg peptide P genoemd (6). Het peptide is zeer gelijkaardig in opeenvolging aan het leucine ritssluitingsdomein van de gist transcriptional activator GCN4, behalve dat het geen leucine ritssluiting vormt omdat het twee Proline residuen bevat. (Prolines zijn niet compatibel met de spiraalvormige bouw van een leucine ritssluiting, dat is een dimeer van spiralen rond elkaar gewikkeld.) Echter, het antilichaam kruis-reageert met de gcn4 leucine ritssluiting, en deze kruisreactie volgt duidelijk een conformationele selectieweg. Het antilichaam reageert met de uitgevouwen peptide, die wordt geleverd door de gevouwen leucine ritssluiting (reactie 3). Het vergelijken van de oorspronkelijke reactie van het antilichaam met peptide P op de kruisreactie met de leucine ritssluiting GCN4, men verwacht dat de kruisreactie langzamer is aangezien het antilichaam een kleine hoeveelheid uitgevouwen peptide in evenwicht met een grote hoeveelheid gevouwen leucine ritssluiting moet selecteren. Bovendien zal de snelheid van de kruisreactie met de overwegend gevouwen leucine ritssluiting een niet-lineaire afhankelijkheid van de totale antigeenconcentratie vertonen, maar een lineaire afhankelijkheid van de concentratie van de kleine hoeveelheid uitgevouwen peptide (8, 15). Dit zou niet het geval zijn voor een geïnduceerd-fit mechanisme, dat bifasisch zou moeten zijn, waarbij de eerste fase correspondeert met een bimoleculaire associatiereactie waarvan de snelheid lineair afhankelijk is van de totale antigeenconcentratie en de tweede fase met een concentratie-onafhankelijke conformationele herschikking. Figuur 2 toont de werkelijke gegevens. De vormingssnelheid van het antigeen-antilichaamcomplex hangt lineair af van de concentratie van de kleine hoeveelheid uitgevouwen peptide en niet lineair van de totale antigeenconcentratie (Fig. 2 bis). Figuur 2B toont de kinetische sporen van de snellere reactie met het oorspronkelijke antigeen en de langzamere reactie met de gcn4 leucine-rits. Niettemin, conformationele selectie van de ontvouwde leucine ritssluiting is nog steeds ordes van grootte sneller dan een geïnduceerde-fit route omdat binding van het antilichaam aan de gevouwen leucine ritssluiting (reactie 1 van Fig. 1) is extreem zwak (1).

het energielandschapsmodel van eiwitconformatie

gevouwen eiwitten hebben geen enkele unieke structuur, maar worden beter beschouwd als een groot ensemble van soortgelijke structuren met vergelijkbare energie-inhoud. Deze zogenaamde conformatoren zijn in snel tempo met elkaar in beweging (10). Als het energielandschap glad is, wisselen de vele conformers snel af. Als het robuust is, kan het ensemble conformers bevatten die heel anders kunnen zijn en langzamer uitwisselen. De selectie tussen de structuren B en B* is dus een grofweg oversimplified beeld. In werkelijkheid is het meer een selectie tussen zeer veel meer of minder passende structuren (13). Echter, het eindresultaat van conformationele selectie is hetzelfde: die conformers die de beste pasvorm tonen binden het beste.

conclusies

conformationele selectie is een waardevol alternatief voor geïnduceerde fit. Dit wil niet zeggen dat binding door geïnduceerde pasvorm niet optreedt. Eigenlijk lijkt een combinatie van conformationele selectie en geïnduceerde pasvorm de beste beschrijving te zijn van de interactie tussen moleculen die blijkbaar niet optimaal passen om te beginnen. We kunnen ons een selectie voorstellen tussen deels passende structuren, gevolgd door kleine aanpassingen aan het uiteindelijke stabiele complex (dat volgens de landschapstheorie zelf een ensemble is van soortgelijke conformers). Het belangrijkste punt is dat geïnduceerde fit geen remedie kan zijn-alles zoals vaak wordt beweerd in de literatuur. De veroorzaakte pasvorm vereist één of andere voorafgaande moleculaire overeenkomst om voldoende affiniteit vóór conformational aanpassing te verstrekken. Als niet aan deze voorwaarde wordt voldaan, leidt de veroorzaakte pasvorm tot een kinetisch knelpunt, zelfs als de algemene reactie thermodynamisch haalbaar is.ik ben veel van mijn vroegere en huidige collega ‘ s dankbaar voor nuttige en stimulerende discussies.

het werk van mijn laboratorium werd gedeeltelijk ondersteund door de Zwitserse National Science Foundation.