molekulární rozpoznávání indukovaným Fit: jak Fit je koncept?

prakticky všechny biologické jevy závisí tak či onak na specifickém molekulárním rozpoznávání. Na konci 19. století, Emil Fischer vytvořil jeho slavný zámek a klíč analogie k obrazu specifičnost enzymatické reakce, které jsou molekulární předpoklad života (4). Enzym byl považován za tuhou šablonu, ve které se substrát musel vejít jako klíč do zámku. V průběhu let se však ukázalo, že tuhé uložení mezi předem vytvořenými molekulárními strukturami nemůže vysvětlit všechny aspekty enzymové katalýzy. Například proč by menší substrát neměl zapadat do aktivního místa enzymu určeného pro větší substrát? Nebo proč jsou některé enzymy vysoce selektivní, ale jiné mohou pojmout několik strukturálně odlišných molekul substrátu?

právě v této souvislosti před více než 40 lety Daniel Koshland formuloval koncept indukovaného fit (7). Pro usnadnění enzymatické reakce v nepřítomnosti přesného uložení předpokládal, že „substrát může způsobit znatelnou změnu trojrozměrného vztahu aminokyselin v aktivním místě“ (7). Představa, přesné fit byl zachován od zámek a klíč obrázku, ale to bylo výslovně uvedeno, že fit“, se vyskytuje pouze po změny vyvolané samotný substrát“ (zvýraznění původní). Koncept brzy se stal učebnice znalosti a od té doby byl používán vysvětlit všechny druhy molekulární rozpoznávání procesů daleko za enzym-substrát reakce. Ve skutečnosti, strukturální analýza interakce biomolekul je založena znovu a znovu, že komplexní a jeho volné molekuly se mohou lišit v detailech konstrukce, ve zjevném podporu uznání vyvolané fit. Dobrým příkladem je několik komplexů antigen-protilátka, u nichž byla prostorová adaptace prokázána analýzou krystalové struktury s vysokým rozlišením (2). Strukturální plasticita je také patrná v jiných interakcích protein-protein (12).

proč by se člověk měl ptát na časově uznávaný koncept? Můj důvod je, že indukovaný fit paragon je často příliš připraven na to, aby vysvětlil, proč molekuly bez zjevné strukturální komplementarity interagují. Problém spočívá v původní předpoklad, že příznivý fit vyvíjí až po původní vazba, která je často brát příliš doslova. Vzhledem k kinetiky a termodynamiky závazné reakce, vyvolané fit je možné pouze tehdy, pokud zápas mezi interakci míst je dost silný, aby poskytnout počáteční složité dost síly a dlouhověkosti tak, že indukované fit se koná v přiměřené lhůtě. Tento klíčový bod bych rád ilustroval jednoduchým modelovým výpočtem založeným na termodynamickém cyklu znázorněném na obr. 1. Zvažte molekuly a A B, které mohou být enzym a substrát, antigen a protilátka, hormon a receptor nebo jakýkoli jiný pár interagujících molekul. Pro zjednodušení také předpokládám, že indukované fit se vyskytuje pouze v molekule B, která se mění na B* za vzniku stabilního komplexu AB*. (Tento předpoklad nemá vliv na výsledek výpočtu, ale zjednodušuje matematický formalismus.) Vazba indukovaným fitem je popsána reakcemi 1 a 2 z obr. 1. V reakci 1 interagují a A B za vzniku počátečního komplexu AB, což je volně vázaný pár molekul. Přesné a energeticky příznivé interakce se následně vytvoří v reakci 2, ve které je B nucena do konformace B* indukovaným fit. Energie pro“ tahání „a“ tlačení “ B do tvarové konformace pochází z optimalizovaného uložení dosaženého v konečném komplexu AB*. Celková vazebná konstanta pro komplex AB* je K = K1 × K2 = k1 × k2 / k–1 × K–2 (viz obr. 1 pro definice vazebných konstant a kinetických rychlostních konstant).

Jako praktický příklad, představte si, antigen-protilátka komplexu, pro které K je obvykle řádově 108 M–1. Protože reakce 1 je nepříznivá, beru K1 jako 1 M-1, z čehož vyplývá, že K2 = 108 M–1. Protože k2 >> K1, rovnováha je dobře na straně komplexu antigen-protilátka AB*. Například, pokud 1 × 10-6 M protilátka reaguje s 1 × 10-6 M antigen, termodynamické rovnováze je 91% na straně antigen-protilátka komplexu (vypočteno z K = 108 M–1 a celkem = celkem = 1 × 10-6 M, kde hranaté závorky označují koncentrace). Důležitou otázkou, která je často přehlížena, je, jak dlouho bude trvat dosažení této rovnovážné koncentrace. Časový průběh je popsán

1

2

vypočítat čas k dosažení rovnováhy, člověk potřebuje přiměřené odhady k1 a k2 (k–1 a k–2 postupujte od zvolené hodnoty K1 a K2; viz Obr. 1). Rychlost tvorby velmi slabého komplexu může být kdekoli mezi 102 A 106 M-1 * s-1. Volím k1 = 104 M-1 * s-1; hodnota k1 však nemá velký vliv na výsledek výpočtu. Konformační změny v proteinech mají poločasy milisekund, takže volím k2 = 102 s–1 (poločas = 7 ms, z ln2/k2). Odpovídající hodnoty zpětných reakcí jsou pak k-1 = 104 s-1 a k-2 = 10-6 s-1. Numerické integrace rovnic 1 a 2 pro výše uvedené rychlostní konstanty a 1 × 10-6 M počáteční koncentrace antigenu a protilátky dává poloviční úvazek pro tvorbu antigen-protilátka komplexu ~2,5 h. Tedy dosažení rovnováhy trvá ~1 den (~10 a půl-krát). Důvodem této dlouhé reakční doby je to, že po vytvoření má nestabilní komplex antigen-protilátka AB jen velmi malou šanci podstoupit indukovaný fit přechod na stabilní komplex antigen-protilátka AB*. Indukované fit, i když termodynamicky rozumné, je příliš pomalé na to, aby bylo smysluplné jako biologická reakce.

Konformační výběr je alternativou k indukované fit

Další vědci, včetně mě (1, 3, 5, 8, 13, 14) poukázal na to, že tam je alternativní mechanismus indukované fit. Podstata konformačního výběru, popsaná reakcemi 3 a 4 z obr. 1, je, že změna konformace se nepředpokládá po počáteční vazbě. To je poměrně zřejmý předpoklad. Vezměte komplex antigen-protilátka AB*. Reakcí 4 se disociuje na volnou protilátku A a volný antigen B*. Proto se B* vyskytuje izolovaně, i když se může jednat pouze o krátkodobou minoritní konformaci, která se rychle vyrovnává s hlavní konformací B reakcí 3. Pro výpočet, jak dlouho trvá dosažení rovnovážné koncentrace AB * konformačním výběrem, předpokládám, že jedna z tisíců molekul je v konformaci B* (K3 = 10-3). Z toho vyplývá, že K4 = 1011 M–1 od termodynamického cyklu podle obr. 1 musí být splněn podle K1 × K2 = K3 × K4 = k = 108 M–1. Dále předpokládám, že konformační změna B → B* je stejně rychlá jako indukované uložení (k2 = k3 = 100 s-1). Dále je třeba hodnotu rychlosti asociace B * S a v reakci 4. Naměřené rychlostní konstanty pro vazbu antigen-protilátka jsou v rozmezí 104-107 M-1 * s–1 (8, 9, 11). Zvolím střední hodnotu k4 = 106 M-1 * s-1. Za těchto podmínek, tvorbu antigen-protilátka komplexu AB* prostřednictvím reakce 3 a 4 má poločas pouze 80 s; rovnovážné koncentrace AB* je dosaženo v <15 min.

Tyto výpočty ukazují, že vazba prostřednictvím indukovaných fit dává smysl pouze tehdy, pokud existuje určité míry již existujících doplňkovost mezi interagujících druhů; jinak je počáteční komplex AB příliš krátký (předpoklad implicitní v Koshlandově počátečním dokumentu). Pomocí výše uvedených vpřed rychlostní konstanty k1 a k2 a 1 × 10-6 M počáteční koncentrace, člověk zjistí, že K1 má být ~104 M–1 k dosažení stejné poloviny-čas 80 s pro indukované fit cesta jako pro konformační výběr dráhy.

experimentální demonstrace vazby konformační selekcí

překvapivě málo studií se pokusilo prokázat konformační selekci navzdory skutečnosti, že je snadněji prokázána než indukovaná fit (1, 5, 8, 15). K prokázání indukovaného přizpůsobení by člověk musel v průběhu vazebné reakce vzorkovat strukturální informace, což je poměrně obtížný úkol. K prokázání konformační výběr, musí ukázat, že rychlost tvorby komplexu AB* je lineárně úměrná koncentraci montáž conformer B* a nonlinearly úměrná celkové koncentraci B + B*. Pokud jeden může měřit konformační rovnováhy reakce 3 v nepřítomnosti závazné partnera, lze vypočítat koncentraci B* a předvídat celkovou rychlost tvorby AB*.

no-studoval příkladem je reakce single-chain fragment protilátek namířených proti 33-zbytek-dlouhé prolin obsahující peptid GCN4-7P14P, tzv. peptid P pro krátkodobé (6). Peptid je velmi podobné v sekvenci k leucin zipper domény kvasinek transkripční aktivátor GCN4, kromě toho, že netvoří leucin zipper, protože obsahuje dvou prolinových zbytků. (Proline nejsou kompatibilní se spirálovou konformací leucinového zipu, což je dimer spirál navinutých kolem sebe.) Nicméně, protilátka cross-reaguje s GCN4 leucin zipper, a tento kříž-reakce jasně vyplývá, konformační výběr dráhy. Protilátka reaguje s rozloženým peptidem, který je dodáván ze složeného leucinového zipu (reakce 3). Srovnání původní reakce protilátek s peptidu P na křížové reakce s leucin zipper GCN4, jeden očekává, že cross-reakce je pomalejší, protože protilátky má vybrat malé množství rozložil peptid v rovnováze s velkým množstvím složené leucin zipper. Navíc, míra křížové reakce s převážně složené leucin zipper vykazují nelineární závislost celkové koncentrace antigenu ještě lineární závislost na koncentraci malé množství rozložil peptid (8, 15). To by nemělo být případ pro indukované-fit mechanismus, který by měl být dvoufázová, první fáze odpovídající bimolecular sdružení reakce, jejíž rychlost závisí lineárně na celkové koncentrace antigenu a druhá fáze na koncentraci nezávislý konformační uspořádání. Obrázek 2 ukazuje skutečná data. Rychlost tvorby komplexu antigen-protilátka závisí lineárně na koncentraci malého množství rozloženého peptidu a nelineárně na celkové koncentraci antigenu(obr. 2A). Obrázek 2B ukazuje kinetické stopy rychlejší reakce s původním antigenem a pomalejší reakci s gcn4 leucinovým zipem. Nicméně, konformační výběr rozložil leucin zipper je stále řádově rychlejší než vyvolané-fit stezku, protože vazba protilátky na složené leucin zipper (reakce 1 Obr. 1) je extrémně slabý (1).

energie krajiny model bílkovin, konformace

Složené bílkoviny nemají jediný unikátní strukturu, ale jsou lepší považovat za velký soubor podobných staveb, které mají podobný obsah energie. Tyto takzvané konformátory jsou ve vzájemném rychlém kolísání (10). Pokud je energetická Krajina hladká, mnoho konformátorů se rychle vyměňuje. Pokud je robustní, soubor může obsahovat konformery, které mohou být zcela odlišné a výměna pomaleji. Výběr mezi strukturami B a B* je tedy hrubě zjednodušený pohled. Ve skutečnosti je to spíše jako výběr mezi mnoha více či méně montážními strukturami (13). Nicméně, konečný výsledek konformační výběr je stejný: ti, conformers, které ukazují, nejlepší fit vázat nejlepší.

závěry

konformační výběr je cennou alternativou indukovaného fit. Tím nechci říci, že k vazbě indukovaným fit nedochází. Ve skutečnosti, kombinace konformační výběr a indukovaný fit se zdá být nejlepší popis interakce mezi molekulami, které zřejmě nejsou optimálně hodí začít. Můžeme si představit, výběr mezi částečně přiléhající struktury, následuje drobné úpravy na konečné stabilní komplex (což podle krajiny teorie je sama o sobě kompletu podobné conformers). Hlavním bodem je, že indukované fit nemůže být lékem, jak je často uváděno v literatuře. Indukované přizpůsobení vyžaduje určitou předchozí molekulární shodu, aby byla zajištěna dostatečná afinita před konformační adaptací. Pokud tato podmínka není splněna, indukované přizpůsobení vede do kinetického úzkého hrdla, i když je celková reakce termodynamicky proveditelná.