indflydelsen af Fødevarematrice Delivery System på biotilgængeligheden af Vitamin D3 (DFORT)

baggrund det aktuelle projekt er en del af vitamin D befæstning med forbedret biotilgængelighed studieprogram (akronym: DFORT), som er et tværfagligt projekt, herunder forskningsgrupper fra Danmark, Spanien og Holland støttet af Innovationsfonden. Det overordnede mål med DFORT er at udvikle mere effektive strategier for vitamin D-befæstning ved at undersøge indflydelsen af leveringsmatricen på biotilgængeligheden af vitamin D. DFORT er organiseret i fire videnskabelige arbejdspakker.

de to første arbejdsprogrammer har til formål at undersøge, om kompleks dannelse (nano-indkapsling) af D-vitamin med forskellige proteiner kan forbedre stabiliteten af D-vitamin (arbejdsprogram 1 ledet af prof. Effekten af kompleksdannelse i rigtige fødevaresystemer, herunder undersøgelser af stabiliteten under opbevaring, lys – og varmeeksponering (AP2 ledet af lektor Trine Kastrup Dalsgaard, AU-FOOD). 1+2 har vist, at D-vitamin kan stabiliseres ved kompleks dannelse med valleprotein, og at indkapslingen kan forårsage mindre iltning og derved forbedre stabiliteten af D-vitamin i forskellige fødevaresystemer.

i den aktuelle undersøgelse (AP 3 ledet af prof. Lars Rejnmark, AU-Health), biotilgængeligheden af D-vitamin i forskellige fødevarematricer (inklusive kompleks dannelse med valleprotein) vil blive undersøgt hos mennesker. Biologiske prøver vil blive indsamlet i arbejdsprogram 3, der muliggør metabolomiske undersøgelser af mulige sammenhænge mellem vitamin D-tilskud gennem forskellige fødevarematricer og metabolisk fænotype (arbejdsprogram 4 ledet af prof. Hanne C. Bertram, AU-FOOD).

selvom det meste af det samlede krop vitamin D syntetiseres i huden efter eksponering for UV-lys (bølgelængde på 290-315 nm), kræver de fleste individer i det mindste noget diæt vitamin D for at opretholde en fyldt vitamin D-status. Dette gælder især om vinteren. Med en breddegrad på 56 liter N i Danmark er der ingen endogen syntese af D-vitamin i månederne fra oktober til April, hvilket betyder, at indbyggerne er nødt til at stole på fødekilder for at opretholde en fyldt D-vitaminstatus. Cholecalciferol (vitamin D3) er den vigtigste diætkilde til D-vitamin, men den er kun til stede i et begrænset antal fødevarer (såsom fed fisk), hvilket gør det vanskeligt at opnå det anbefalede indtag på 10 liter D3 pr.

D-vitaminstatus kan forbedres som reaktion på et øget indtag af D-vitamin i form af enten tilskud med tabletter eller fødevareforstærkning. Talrige undersøgelser har vist øgede 25-hydroksi vitamin D (25ohd) niveauer som reaktion på et øget indtag af vitamin D. Det antages generelt, at gennemsnitlige 25ohd-koncentrationer stiger med 0.7 nmol / L som reaktion på et øget langtidsindtag af 1 liter D-vitamin pr.dag, selvom den relative stigning pr. mikrogram suppleret kan være højere, hvis baseline-niveauerne er lave. På trods af dette velkendte dosis-respons-forhold i grupper af mennesker har flere undersøgelser dokumenteret, at ændringen i serum 25ohd-niveauer som reaktion på vitamin D-tilskud varierer meget.

flere grunde kan redegøre for den interindividuelle variation som reaktion på vitamin D-tilskud. Groft sagt kan variationen skyldes unøjagtigheder i doseringen (uoverensstemmelser mellem påståede og faktiske værdier af D-vitamin) og variation i biotilgængeligheden af D-vitamin.

uoverensstemmelser mellem anpriste og målte værdier af D-vitaminindhold i d-tabletter og fødevarer-berigede produkter kan skyldes uoverensstemmelser i dosis, der anvendes til befæstning eller ustabiliteten af vitaminet i sig selv. Der er rapporteret om uoverensstemmende resultater om stabiliteten af D-vitamin i forskellige fødevarematricer og når de udsættes for forskellige fysiokemiske farer. Nogle forskere har rapporteret, at D-vitamin er ustabilt, mens andre har fundet det bemærkelsesværdigt stabilt, når det udsættes for iltning, lys og syre og alkali.

kun få undersøgelser har søgt efter faktorer, der er ansvarlige for den interindividuelle variation i 25ohd-niveauer som reaktion på vitamin D-tilskud. Disse undersøgelser har antydet, at kropssammensætning (inklusive fedtmasseindhold), genetiske varianter af vitamin D-bindingsproteinet (VDBP)og forholdet mellem serum 24,25-dihydroksy vitamin D (24,25(OH) 2D) og 25ohd kan bidrage til variation i serum 25ohd-niveauer. I en nylig undersøgelse kunne kun 47% af variationerne i responsen på D-vitamintilskud forklares ved at tage højde for faktorer af kendt betydning for ændringer i 25ohd-niveauer.

ud over de ovennævnte indekser kan faktorer af betydning for tarmabsorptionen af D-vitamin såvel som fødevarematricen, hvormed vitamin D-tilskud tilvejebringes, bidrage til interindividuelle variationer i 25ohd-responser. Imidlertid er der kun få undersøgelser tilgængelige om biotilgængeligheden af D-vitamin fra forskellige fødevarematricer og tarmabsorptionen af D-vitamin, herunder den intraluminale skæbne, og molekylære mekanismer, der letter absorptionen, forstås stadig kun delvist.

da D-vitamin er et fedtopløseligt molekyle, er det generelt antaget, at D-vitamin absorberes i tyndtarmen ved simpel passiv diffusion med D-vitamin, der inkorporeres i micellen og transporteres af chylomicroner via lymfe vener til leveren. Dette er i overensstemmelse med undersøgelser, der viser en øget risiko for lave 25ohd-niveauer hos patienter med fedtmalabsorption. Det er derfor blevet foreslået, at indtagelse af D-vitamin sammen med et måltid rig på fedt kan øge frigivelsen af galde, hvilket muliggør en øget inkorporering af D-vitamin i galdesaltmicellen og derved forbedrer biotilgængeligheden af D-vitamin.imidlertid er der rapporteret om uoverensstemmende resultater om, hvorvidt sammensætningen af fødevarematricer (og dets fedtindhold), hvormed D-vitamin indtages, påvirker dets biotilgængelighed.

i et randomiseret, kontrolleret forsøg af Raimundo et al. var den gennemsnitlige ændring i 25ohd-niveauer To uger efter behandlingen med en enkelt stor oral dosis på 50.000 IE D3 større, når måltidet havde mindst 15 g fedt sammenlignet med et fedtfrit måltid. I modsætning hertil blev fedtindholdet i fødevarematricer ikke fundet at påvirke tidskoncentrationsprofilen målt ved vitamin D2-niveauer i plasma 2, 4, 8, 12, 48, og 72 timer efter indtagelse af en enkelt dosis på 25.000 IE D2 tilsat enten sødmælk, skummetmælk eller opløst i 0,1 mL majsolie og påført toast. Imidlertid er begge disse undersøgelser begrænset af brugen af meget høje (farmakologiske) doser af D-vitamin, som kan tilsidesætte enhver fysiologisk virkning af sammensætningen af fødevarematricer.

manglende effekt af fedtindholdet i den mad, hvormed D-vitamin indtages, understøttes også af undersøgelser af vitamin D-befæstning af appelsinsaft. Sammenligning af biotilgængeligheden af D-vitamin tilsat appelsinsaft eller suppleret som kapsler viste en lignende stigning i 25ohd-koncentrationer som respons på 11 ugers tilskud med 1000 IE D-vitamin pr. Det faktum, at D-vitamin kan absorberes tilstrækkeligt efter et fedtfrit måltid (såsom appelsinsaft), kan forklares med nylige fund om den mekanisme, hvormed D-vitamin absorberes. Det ser ud til, at D-vitamin ikke kun absorberes ved simpel passiv diffusion (ved inkorporering i micellen), da kolesterolmembrantransportører, såsom SR-BI, CD36 eller NPC1L1, har vist sig at være involveret i absorptionen. Forskelle i ekspressionsniveauer og eksistensen af funktionelle polymorfier i generne, der koder for disse proteiner, kan også bidrage til den store interindividuelle variation i postprandial respons på D-vitamin.

kun meget få undersøgelser er tilgængelige på tidsplasmakoncentrationsprofilen for D-vitamin efter indtagelse af en oral dosis. Denker et al. undersøgte den farmakokinetiske profil af D3-vitamin efter administration af en enkelt D3-dosis på enten 2800 eller 5600 IE, hvilket viste, at plasma-D3-niveauer steg støt efter indtagelsen og toppede ved 9 og 2,3 timer med koncentrationer, der vendte tilbage til næsten baseline-værdier med 72 timer. Det vides ikke, om fødevarematricen (inklusive kompleks dannelse af D-vitamin ved indkapsling med valleproteiner) påvirker biotilgængeligheden af D-vitamin vurderet ud fra plasmatidskoncentrationsprofilerne, og om dette kan påvirke den interindividuelle variation som reaktion på D-vitamintilskud.

betydningen af calciumindtag og især calciumindtag fra mejeriprodukter og tabletter (kosttilskud) er blevet undersøgt i en række undersøgelser, der viser uoverensstemmende resultater. En Cochrane meta-analyse har antydet en samlet gavnlig effekt af øget calciumindtag fra mejeriprodukter og calciumtilskud. En nylig undersøgelse har imidlertid antydet en stigning i blodtrykket i timerne efter indtagelse af 1000 mg calciumcitrat sammenlignet med placebo. Det er hidtil ikke blevet undersøgt, om mælkeindtagelse forårsager lignende virkninger på indekser for hjerte-kar-sundhed, herunder blodtryk og arteriel stivhed.

formål det overordnede mål med undersøgelsen er at undersøge indflydelsen af forskellige fødevarematricer (inklusive kompleksdannelse med valleproteiner) på biotilgængeligheden af D-vitamin, som vurderet ved hjælp af maksimale koncentrationsprofiler (Cmaks) og tidskoncentrationskurven for D3 i plasma og dermed om den interindividuelle variation i absorptionen af D-vitamin kan afhænge af afgivelsessystemet.

Co-primær (null-) hypotese:

• fødevarematricen, hvormed D3 leveres, påvirker ikke Cmaks af D3 som bestemt 10 timer efter dosering.
• absorptionsprofilen (tidskoncentrationskurve med hensyn til areal under kurven fra 0h til 12h ) adskiller sig ikke alt efter fødevarematricen, hvormed D3 leveres.

sekundære (null-)hypoteser

• sammenlignet med D-vitamin tilvejebragt som dråber forbedres absorptionen af D3 ikke ved levering gennem hver af de testede fødevarematricer (dvs.øget Cmaks).
• sammenlignet med D-vitamin tilsat til juice forbedres absorptionen af D3 ikke af valleproteinkompleksbundet D3 (dvs.øget Cmaks).
• behandlinger påvirker ikke plasmaniveauerne af parathyroidhormon (PTH) og ioniseret calcium.
• variabiliteten af D-vitamintilskud med hensyn til Cmaks er lavere, hvis D-vitamin er kompleksbundet til valleproteiner sammenlignet med de andre testede tilskudsmetoder.
• arteriel stivhed som vurderet ved tonometri påvirkes ikke af mælkeindtagelse.

forklarende hypoteser for at muliggøre yderligere undersøgelser af indekser af betydning for reaktioner på vitamin D-tilskud, data indsamles om kropssammensætning, genetiske polymorfier, kolesterolstatus og sædvanlige kostvaner.

materialer og metoder

studiedesign undersøgelsen udføres som en multiple cross-over-undersøgelse ved hjælp af et afbalanceret latin-firkantet design. Dette design gør det muligt for hver deltager at fungere som sin egen kontrol og derved modvirke risikoen for en negativ indflydelse på resultaterne af behandlingsrækkefølgen eller andre faktorer såsom effekt af periode såvel som interindividuelle variationer, der kan tilskrives f.eks. genetiske variationer, kropsvægt osv. Ved randomisering tildeles hver deltager til at modtage alle de fem behandlingsregimer i en forud specificeret rækkefølge med en 10-21 dages udvaskningsperiode mellem hver af behandlingsarmene.

behandlingssekvenserne er:

Behandlingssekvens 1: A B E C D

behandlingssekvens 2: B C A D e

behandlingssekvens 3: C D B E a

behandlingssekvens 4: D E C A B

behandlingssekvens 5: e a d b c

behandlingssekvens 6: D C E B A

behandlingssekvens 7: E D A c b

behandlingssekvens 8: A E B D c

behandlingssekvens 9: B A C E d

Behandlingssekvens 10: C B D A e

procedurer til håndtering af D-vitamintilskud supplementet erhverves kommercielt og opbevares på Osteoporoseklinikken, Aarhus Universitetshospital og holdes væk fra anden medicin og tilskud. Sub-investigator er ansvarlig for korrekt håndtering og udlevering af vitamin D supplement, samt at sikre, at tillægget kun vil blive brugt som beskrevet i protokollen, og at deltagerne bliver bedt om at tage det korrekt.

procedurer for randomisering randomisering udføres ved hjælp af en computergenereringsliste. Behandlinger vil ikke blive blindet for efterforskeren. Med hensyn til sammenligning af juice med eller uden valleproteinbundne komplekser vil et enkeltblindt design blive anvendt, da deltagerne ikke får at vide, hvilken af de behandlinger de modtager. Hver behandlingssekvens tildeles det samme antal patienter – f.eks. 3 deltagere vil være i behandlingssekvens 1, 3 i behandlingssekvens 2 osv.

befolkning tredive deltagere rekrutteres fra den generelle baggrundspopulation ved direkte mail ved hjælp af en liste over tilfældigt udvalgte personer, der bor i Aarhus område genereret af “Research services” på Statens Serum Institut. Undersøgelsen udføres om vinteren (November-April).

tilbagetrækning og frafald enhver deltager kan til enhver tid droppe ud af undersøgelsen uden nogen forklaring og behøver ikke at gennemgå en afsluttende undersøgelse. Efterforskeren kan trække en deltager tilbage, hvis dette synes nødvendigt for deltagerens sikkerhed. Frafald og udbetalinger vil blive noteret og forklaret i CRF.

tilbagetrækning vil ske i tilfælde af, at et af følgende kriterier er opfyldt:

• ændring i vitamin D-tilskud
• ioniseret calciumkrist 1.40 mmol/l
• sygdom eller ny medicin, der vil påvirke undersøgelsen
• alvorlige bivirkninger/symptomer, der forventes at være forårsaget af D-vitamintilskud sygdomme, der opstår inden for 7 dage efter behandlinger, kan være en mulig årsag til deltagelse i undersøgelsen. Underforsker kan i denne tidsramme kontaktes for at undersøge, om det er en årsag til vitamin D-tilskuddet. Hvis det er tilfældet, vil symptomerne eller sygdommen blive fulgt, indtil den er helbredt eller er blevet kronisk.

undersøgelsesdeltagere vil blive undersøgt 5 gange over en tidsperiode på 6 til 12 uger. 9 og forbliver på afdelingen, indtil blodprøveudtagning kl 12 timer er taget. Herefter er deltagerne fri til at gå hjem og komme tilbage den følgende dag i 24 timers blodprøvetagning og levere urinprøverne eller overnatte på hospitalet. I løbet af de 12 timer på afdelingen får deltagerne standardiseret mad.

grundlæggende sundhedsoplysninger og spørgeskemaer:

deltagerne vil besvare spørgeskemaer vedrørende deres generelle helbred såvel som kostvaner og soleksponering.

biokemi:

blodprøver vil blive indsamlet på forskellige tidspunkter (0, 2, 4, 6, 8, 10, 12, 24 timer).

alle målinger udføres, når alt materiale fra alle 30 deltagere er indsamlet for at undgå variation i resultater. Blodprøver opbevares i en biobank i maksimalt 15 år efter afslutningen af undersøgelsen.

urinprøver:

urin opsamles i 3 batcher på den første dag i hver dosering, dvs.fra 0-4 timer, fra 4-8 timer og fra 8-24 timer.

alle målinger udføres, når alt materiale fra alle 30 deltagere er indsamlet.

knoglescanninger:

Dual-Energy røntgenabsorptiometri (Dksa) og perifer kvantitativ computertomografi med høj opløsning (hrpkct):

dksa-scanning med den Halologiske Discovery-scanner. Knoglemineraltæthed (BMD) måles i lændehvirvelsøjlen (L1-L4), lårbenshalsen og den distale underarm. Desuden vil den samlede kropssammensætning blive bestemt, inklusive fedt-og magert vævsmasse.

en knoglescanning af den distale radius og tibia udføres ved hjælp af en CT-scanner (SCANCO Medical AG, Sverige). Dette giver mulighed for vurdering af volumetrisk BMD for kortikal og trabekulær knogle, knoglestruktur og geometri (inklusive kortikal og trabekulær tykkelse, trabekulær adskillelse osv.) og knoglestyrke.

blodtryksmålinger og tonometri:

blodtryk og målinger af arteriel stivhed (tonometri) udføres to gange i hver deltager i forhold til behandlingsregimer “C” og “D”.

ved begge lejligheder udføres målinger om morgenen med deltageren i fastende tilstand. Når målingerne er udført, får deltageren interventionen sammen med et morgenmadsmåltid. Herefter faster deltageren, indtil næste måling udføres fire timer senere.

Kontor Blodtryk (BP) måles i en siddeposition efter 5 minutters hvile på højre overarm ved hjælp af en digital automatisk BP-skærm. Tre BP-aflæsninger udføres med 2 minutters hvile imellem. Gennemsnittet af de sidste to målinger registreres.

arteriel stivhed og pulsbølgehastighed (PVV) vil blive vurderet ved hjælp af tonometri ved hjælp af SphygmoCor-systemet (Atcor Medical, Sydney, nSv, Australien). Til målinger af carotis-til-femoral PV, en oppustet femoral manchet placeret på højre øvre lår kombineret med carotis applanation tonometri vil blive brugt. Målinger udføres i et stille rum. Deltageren hviler i 10 minutter i liggende stilling inden teststart. Brachial BP måles på højre overarm, og to på hinanden følgende BP-aflæsninger udføres. Hvis BP-aflæsninger ikke adskiller sig med > 5 mmHg, registreres den sidste. Hvis BP-aflæsninger afviger med > 5 mmHg, opnås fire BP-aflæsninger. Gennemsnittet af de sidste to målinger registreres. Aiks vurderes som forholdet mellem bølgerefleksionsamplitude og centralt pulstryk. Gennemsnittet af to målinger anvendes i analyserne. Carotis-femoral VV vurderes som den tilbagelagte afstand divideret med transittiden ved hjælp af den direkte carotis-til-manchet-afstand målt med et ikke-strækbart bånd (infantometer). Mindst to målinger udføres. Hvis målingerne afviger < 0,5 m/s, anvendes gennemsnittet af de to målinger til analyser. Hvis PV afviger med > 0,5 m/s, opnås en tredje måling, og medianværdien anvendes til analyser. I henhold til generelle anbefalinger er den direkte carotid-til-manchet-afstand gennemsnitlig PVV multiple med 0,8.