Industrialisering er forbundet med forhøjede hastigheder af vandret genoverførsel i det humane mikrobiom

hovedtekst

tarmbakterier, der lever i symbiose med mennesker, har oplevet høje hastigheder af vandret genoverførsel (HGT) over evolutionær tid, i det mindste på tværs af individer i industrialiserede lande 1,2. Alligevel forbliver det uklart, hvordan HGT-satser sammenlignes med typisk bakteriel opholdstid i den menneskelige tarm, og hvordan den menneskelige værts livsstil kan påvirke hastigheden af HGT og typen af overførte gener.

Hvis tidsskalaen for overførsel er langsommere end opholdstiden inden for værten, vil individuelle mikrobiomer primært erhverve nye funktioner gennem erhvervelse af nye stammer. Men hvis overførselshastigheden er tilstrækkelig hurtig, kan et mikrobiom, der er ‘stabilt’ med hensyn til bakteriepopulationer 3-5, alligevel udvikle sig som reaktion på værtsspecifikke miljøforstyrrelser gennem HGT, måske som reaktion på diæt eller ændringer i kulturel praksis.

specifikke eksempler viser, at HGT kan forekomme inden for et enkelt individ 6-10, især når der er stærkt valg til målfunktioner såsom antibiotikaresistens 11-13. Men hvilken brøkdel af arter i det humane mikrobiom har erhvervet gener fra en anden art i deres seneste menneskelige vært, og hvordan sammenlignes tidsskalaen for HGT med tidsskalaen for menneskelig kolonisering? I vores tidligere undersøgelse 1 fokuserede vi på HGTs, der involverede sekvenser med lighed højere end 99% og længde højere end 500bp. Ved at antage et typisk molekylært ur på ~1 SNP/genom/år 14 og genomstørrelse på 106 bp er disse kriterier i overensstemmelse med overførselshændelser, der skete mellem 0 og 10.000 år siden. For at besvare spørgsmålet om, hvorvidt kommensale stammer rutinemæssigt erhverver ny funktionalitet gennem HGT, er der behov for mere præcise estimater af tidsskalaen for HGT.

for at måle hastigheden af HGT på kortere tidsskalaer sammenlignede vi mængden af overførsel observeret mellem bakterier isoleret fra det samme individ med den observerede mellem bakterier fra forskellige individer. Vi antog, at hvis overførselshastigheden var hurtig sammenlignet med den typiske opholdstid for en bakteriel afstamning, der koloniserede den menneskelige krop, så ville vi observere højere overførselsniveauer mellem stammer isoleret fra den samme vært. Alternativt, hvis tidsskalaen for overførsel var tilstrækkelig længere end en menneskelig levetid, ville vi observere lignende niveauer mellem bakterier, uanset om de var isoleret fra den samme vært. For at fokusere vores Analyse på de seneste begivenheder kiggede vi efter store blokke (>10KB) af 100% identisk DNA, svarende til HGT-hændelser, der opstod mellem 0 og ~100 år siden, selvom vi også bekræfter vores fund ved hjælp af kortere mobile elementer med længde større end 500bp. I denne undersøgelse, Vi fokuserer kun på overførsler, der forekommer mellem bakteriearter, ignorerer genrekombinationshændelser inden for arten.

eksisterende referenceisolatgenomer 4,15-19 kan ikke bruges til at teste for direkte genoverførsel mellem to bakterier i mennesker, fordi næsten alle disse stammer blev isoleret fra forskellige individer. Derudover blev disse referencesamlinger næsten udelukkende udtaget fra industrialiserede befolkninger og afspejler ikke mangfoldigheden af menneskelig livsstil. Derfor analyserede vi hele genomerne af 6.188 nyligt dyrkede bakterieisolater ved hjælp af afføringsprøver indsamlet fra 34 individer i 9 humane populationer over hele verden: i Cameroun, Inuit individer i canadiske arktiske, samiske og finske individer i Finland og individer fra en Northern Plains stamme i Montana og fra Boston-området i USA; supplerende Figur 1 & supplerende tabel 1 for en beskrivelse af livsstil). Vi grupperede bakterielle genomer i artsklynger baseret på genomisk lighed (ved hjælp af Mash-afstanden som en fuldmagt til den gennemsnitlige Nukleotididentitet, se metoder). Disse genomer repræsenterer 253 bakteriearter på tværs af 6 phyla, der grupperes i 62 kendte og 54 ukendte slægter (figur 1a & supplerende tabeller 2 & 3 til dyrkning af data og genomsamlingsstatistikker). De samplede menneskelige populationer havde forskellige genetiske baggrunde og meget forskellige livsstiler, lige fra industrialiserede til Jæger-samler samfund. Vi samplede mange bakterieisolater af forskellige arter inden for hvert individ, og opdagede tusinder af nylige HGTs i vores genomiske data: i alt fangede vi 134.958 mobile elementer på tværs af flere bakteriearter, både inden for og mellem mennesker. 57% af bakteriegenomerne (3556/6188) var involveret i mindst en nylig HGT-begivenhed (figur 1a), hvilket indikerer, at HGT er voldsomt i den moderne menneskelige tarm.

Vi fandt ud af, at bakteriearterpar, der er udtaget i mennesker, er mere tilbøjelige til at dele for nylig overført DNA end de samme artspar, der er udtaget fra to forskellige personer (antallet af observerede HGT-hændelser inden for personen blev sammenlignet med det forventede antal hændelser baseret på antallet af hændelser mellem personer, korrigering for artssammensætning og ujævn prøveudtagningsdybde, figur 1b, p-værdi< 2.2, 10-16, se metoder), og dette signal drives af mange forskellige bakteriearter, der dækker forskellige taksonomiske grupper (figur 1a & 1b). Dette resultat antyder, at tidsskalaen for HGT er kort. Strengt taget kan vi ikke skelne mellem overførsler, der fandt sted i oprindelsesværten, fra dem, der kan have fundet sted hos en værts forælder eller endda bedsteforælder. Det er imidlertid usandsynligt, at en stor del af overførsler fandt sted før kolonisering af værten, fordi den samlede HGT-sats er stor sammenlignet med arveligheden af stammer fra en forælder (se diskussion i supplerende Information). Disse resultater er robuste over for oplysningerne i vores Analyse: en stigning i HGT-frekvens inden for individer replikeres, når analyser begrænses til inden for hver af vores samplede populationer, eller når man overvejer de 5.126.962 mobile elementer, der er større end 500 BP, der er fordelt på 98% (6068/6188) af vores genomer (p-værdi < 2.2 til 10-16) (figur 1a & supp fig. 2 & 3). Tilsammen antyder disse resultater, at HGTs forekommer på tidsskalaer, der er tilstrækkeligt korte til at omforme tarmsamfundsfunktioner i vid udstrækning og kontinuerligt i løbet af en persons levetid.

fordi HGT-frekvens primært er drevet af overførsler, der forekommer blandt nært beslægtede organismer, som har tendens til at udveksle flere gener sammen end fjernt beslægtede arter, undersøgte vi HGT-frekvens over en række fylogenetiske afstande. Vi viser, at fylogenetisk sammenhæng er en stærk drivkraft for HGTs generelt (mere nært beslægtede arter, der overfører flere gener, lineære blandede effekter model fit test, p-værdi < 2.2, 10-16), og at den stærke berigelse til overførsel inden for individer sammenlignet med mellem individer forekommer på tværs af alle fylogenetiske afstande (figur 2a), hvilket gælder, selv når man overvejer alle HGTs større end 500bp (supplerende figur 4).

efter at have etableret den hurtige tidsplan for HGT, spurgte vi derefter, hvilke faktorer der driver genudvekslingsfrekvens i den menneskelige tarm. Vi antog, at par af meget rigelige arter i et givet økosystem ville have en højere sandsynlighed for genudveksling sammenlignet med par, der involverer mindst en lav overflodsart, uafhængig af deres fylogenetiske afstand, skønt vi tidligere argumenterede imod en vigtig rolle for overflod i kontrollen af HGT-frekvens 1. Denne hypotese var aldrig blevet testet direkte, fordi datasæt, der parrede dybdegående genomisk prøveudtagning med nøjagtige overflodestimater, endnu ikke eksisterede. For at teste overflodshypotesen genererede vi metagenomiske data for afføringsprøverne, hvorfra vi havde dyrket bakterieisolater, og beregnet den gennemsnitlige overflod af hver bakterieart inden for hver person ved at kortlægge metagenomiske aflæsninger mod isolatgenomerne (se metoder). Vi fandt ud af, at artens overflod er en stærk determinant for HGT (Linear blandede effekter model fit test, p-værdi = 1,4 luth 10-11), uafhængig af fylogeni (figur 2b), som replikeres, når man ser på alle HGTs større end 500bp (supplerende figur 5). Rigelige bakterier er mere tilbøjelige til at engagere sig i HGT med andre rigelige bakterier, hvilket er i overensstemmelse med de kanoniske mekanismer for HGT (f.eks. konjugation, transformation og transduktion 20), der involverer celle-til-celle-kontakt eller adgang til frit DNA i miljøet.

da HGT er drevet af fylogenetisk afstand og overflod, og overflod er ens på tværs af individer inden for en værtspopulation 5, antog vi, at den samme tarmbakterieart ville udveksle gener på tværs af individer. For at teste denne hypotese sammenlignede vi HGT-frekvenser for par af bakteriearter, der deles af mindst 4 individer inden for vores USA-kohorte. Vi fandt ud af, at HGT-frekvensen er homogen på tværs af mennesker for størstedelen af bakteriearter (den observerede gennemsnitlige standardafvigelse for HGT-frekvens inden for mennesker blev sammenlignet med den forventede fordeling ved hjælp af en randomiseringstest med 1.000 permutationer, p-værdi < 0.001, supplerende figur 6). Dette antyder, at kernesættet med rigelige slægter, der deles af individer inden for en given population, repræsenterer et kernenetværk af genudveksling, der gør det muligt for bakterielinjer at tilpasse sig almindelige selektive tryk, der virker i værtspopulationen.

Vi spurgte derefter, om arkitekturen af cellehylster bidrager til forskelle i HGT-frekvens, uafhængig af fylogeni og overflod. Vi brugte reference Gramfarvningsdata for hver bakterieart som en fuldmagt til cellevægsarkitektur for at adskille gram-positive monodermbakterier (enkelt cytoplasmisk membran og et tykt peptidoglycanlag) fra gram-negative diderm-bakterier (to membraner, der omgiver et tyndt peptidoglycanlag). Vi fandt ud af, at diderm-bakterier engagerer sig hyppigere i HGTs end monoderm-bakterier, uafhængigt af fylogeni og overflod (p-værdi = 1 til 10-3, figur 2C), hvilket også observeres, når man overvejer alle HGTs større end 500 BP (supplerende Figur 7). Interessant nok svarede HGT-frekvensen mellem to diderm-bakterier til HGT-frekvensen mellem en monoderm og en diderm-bakterie, hvilket antyder, at diderm-bakterier har overførselsmekanismer, der giver dem mulighed for at dele DNA-materiale med et meget bredere spektrum af genetiske baggrunde.

overgang fra ikke-industrialiseret til industrialiseret livsstil er forbundet med drastiske ændringer i mikrobiomdiversitet og sammensætning 21-23. Imidlertid, lidt vides om, hvordan disse livsstilsovergange påvirkede mønstrene for genudveksling i det humane tarmmikrobiom.

for at teste, om menneskelige populationer med en industrialiseret livsstil har forskellige HGT-mønstre sammenlignet med populationer med ikke-industrialiseret livsstil, kiggede vi på artsparene i vores datasæt, der deles af individer, der bor i USA (Boston-området) og individer, der bor i en af de fire populationer, hvorfra vi har den største prøveudtagning af bakteriearter: Hadse (jæger-samlere), Datoga (pastoralister), Beti (landbrugere) og Baka (i øjeblikket overgår fra en jæger-samler til en landbrugslivsstil). For hvert bakterieartspar beregnede vi den gennemsnitlige HGT-frekvens på det menneskelige befolkningsniveau og så på delte identiske (100%) DNA-blokke, der er større end 500bp. Overraskende fandt vi, at artspar, der blev udtaget i den amerikanske industrialiserede befolkning, udvekslede gener oftere, end når de findes i ikke-industrialiserede populationer (antallet af observerede ikke-industrialiserede populationshændelser blev sammenlignet med det forventede antal hændelser baseret på antallet af industrialiserede populationshændelser, korrigering for artssammensætning og ujævn prøveudtagningsdybde, p-værdi < 2.2.10-16, se metoder) (figur 3a). Denne effekt gælder, når analysen begrænses til hver ikke-industrialiseret befolkning individuelt sammenlignet med USA (figur 3b). Samlet set viser disse resultater for første gang, at værtslivsstil former genoverførselsfrekvenser i det humane tarmmikrobiom. Disse resultater antyder også, at overgang til industrialiseret livsstil resulterede i en drastisk stigning i genoverførsler inden for tarmmikrobiomet, potentielt på grund af øgede miljøforstyrrelser til tarmbakteriepopulationer.

Vi begrundede, at hvis HGT forekommer på meget korte tidsskalaer, skal typen af gener, der overføres, afspejle det unikke selektive tryk forbundet med forskellige individuelle værter og populationer 24. Ved hjælp af genoverførsler, der involverer arterpar, der findes i både USA-befolkningen og enten hadse -, Beti-eller Datoga-folkene, sammenlignede vi først brede funktionelle kategoriprofiler og fandt ud af, at de adskiller sig på tværs af livsstil (figur 4a, chi-firkantet godhed-af-fit-test, p-værdier < 0.001).

efter at have vist, at der findes brede funktionelle forskelle på tværs af de typer gener, der overføres i forskellige populationer, fokuserede vi på gener involveret i funktioner, som vi troede kan variere på tværs af populationer, herunder gener involveret i mobile elementer (fag, plasmid, transposon), antibiotikaresistens og kulhydratnedbrydende (CAS) funktioner. Vi fandt ud af, at tarmbakterier i industrialiserede populationer udvekslede højere relative mængder plasmid -, transposon-og fagelementer (figur 4b, to-proportions-test, korrigerede p-værdier < 0.001), i overensstemmelse med overordnede højere niveauer af HGT. Personer, der indtager store mængder af ikke-fordøjelige fibre, er vært for tarmbakterier, der udveksler CAS-gener ved højere frekvenser end personer, der bor i USA (figur 4b). Meget høje overførselsfrekvenser af antibiotikaresistensgener blev også fundet i tarmmikrobiomerne hos Datoga-individer. Datoga er pastoralister, der primært opdrætter kvæg og indtager høje niveauer af kød og mejeriprodukter fra deres dyr. Ligesom andre pastorale landmænd i Norddanmark administrerer de antibiotika til deres besætninger 25,26. Vores resultater antyder, at disse nylige landbrugsmetoder hurtigt ændrede fitnesslandskabet i tarmene hos Datoga-mennesker og allerede har påvirket mønstrene for genoverførsler inden for deres mikrobiomer. Da brugen af kommercielle antimikrobielle stoffer nu er udbredt blandt pastoralistiske befolkninger i udviklingslande, kan lignende virkninger forekomme i mange befolkninger over hele verden med bredere indflydelse på spredningen af antimikrobiel resistens uden for klinikken.

talrige undersøgelser har undersøgt, hvordan ændringer i diæt og kliniske interventioner såsom fækale mikrobiotatransplantationer 27,28 påvirker sammensætningen af tarmmikrobiomet. Men det er vanskeligt at udlede mekanistisk forståelse fra kompositionsændringer. Vores undersøgelse afslører, at HGTs inden for tarmmikrobiomet afspejler det unikke selektive tryk fra hver menneskelig vært. Således kan HGT-mønstre derefter bruges til at identificere selektive kræfter, der virker inden for hvert individ og for at få en mere mekanistisk forståelse af disse begivenheder. Vores resultater viser også, at hele genomsekventeringsdata giver information om personlig mikrobiomfunktion på et præcisionsniveau, som populære tilgange, såsom 16S amplicon og metagenomisk sekventering, ikke kan opnå. Endelig er den høje HGT-hastighed i den menneskelige tarm sandsynligvis en nylig udvikling som reaktion på industrialiseret livsstil, som yderligere blev ledsaget af drastiske ændringer i arten af gener, der udveksles. Vi kan endnu ikke fuldt ud forstå konsekvenserne af disse skift i HGT frekvens og funktion på menneskers sundhed.