keratiner i sundhed og kræft: mere end blot epitelcellemarkører

diagnostiske markører i epiteltumorer

i betragtning af de karakteristiske celletype-, differentierings – og funktionelle statusafhængige keratinekspressionsmønstre i epitelceller, tilgængeligheden af specifikke keratinantistoffer og det faktum, at epiteltumorer stort set opretholder træk ved specifik keratinekspression forbundet med den respektive celletype Oprindelse, keratiner har længe og i vid udstrækning været anvendt som immunhistokemiske markører i diagnostisk tumorpatologi (figur 3; Tabel 1) (Moll et al., 2008).

Keratinekspression i human cancer. Keratiner udtrykkes normalt på en celletype -, differentierings-og funktionel statusafhængig måde, og epitelcancer opretholder i vid udstrækning egenskaberne ved keratinekspression forbundet med deres respektive celletype oprindelse, så keratiner er længe blevet anerkendt som diagnostiske markører i tumorpatologi. Eksempler på keratiner, der almindeligvis anvendes til diagnosticering af humane epitheliale maligniteter, præsenteres her.

adenocarcinomer, det vil sige, epitelcancer, der opstår i kirtelvæv, omfatter den største gruppe af humane epitheliale maligniteter og kan opstå i forskellige organer. Evnen til at differentiere adenocarcinomer i henhold til deres oprindelsesvæv er afgørende for udvælgelsen af de mest passende behandlingsregimer, og enkle epitelkeratiner er markørerne, der overvejende anvendes til dette formål. De fleste adenocarcinomer udtrykker de enkle epitheliale keratiner K8, K18 og K19, mens K7 og K20 ekspression er variabel. Keratintypning er af særlig diagnostisk betydning i tilfælde af kolorektale adenocarcinomer, som på samme måde som det normale gastrointestinale epitel næsten altid er K20-positive, men K7-negative (eller har lavere K7-ekspression sammenlignet med K20) (Moll et al., 2008). K20 og K7 co-ekspression er blevet rapporteret som et kendetegn ved mere avancerede kolorektale kræftformer., 2005), mens reducerede K20-niveauer er blevet påvist i forbindelse med høj mikrosatellit ustabilitet (McGregor et al., 2004). Pancreas, galdeveje, esophageal og gastrisk adenocarcinomer udtrykker ensartet K7 og mere variabelt, men op til 65%, K20 (Chu et al., 2000), hvorimod en K7+/K20− fænotype er karakteristisk for ovarie -, endometrie-og lungeadenocarcinomer (Moll et al., 2008). Endometrie adenocarcinomer kan co-udtrykke stratificerede epithelial keratiner, såsom K5, som en indikation af pladeformet metaplasi (Chu og Vaiss, 2002a). Ikke-pladeformede, ondartede spytkirtelcarcinomer er også K7+/K20− med undtagelse af spytkanalcarcinomer, som kan være positive for begge keratiner (Nikitakis et al., 2004). Desuden er næsten alle skjoldbruskkirteltumorer (follikulære, papillære og medullære undertyper) og to tredjedele af maligne mesotheliomtilfælde K7+/K20 -. De sidstnævnte tumorer, i modsætning til de fleste adenocarcinomer, udtrykker konsekvent keratinocyt-type keratiner, især K5 og vimentin., 2006). Appendiceal og lungecarcinoider, binyre kortikale, prostatiske og hepatocellulære carcinomer er negative for både K7 og K20 (Chu, 2002b).

de fleste brystadenocarcinomer, inklusive både duktale og lobulære undertyper, udtrykker konstitutivt K7, K8, K18 og K19. Imidlertid udviser K8 et overvejende perifert farvningsmønster i duktalt karcinom sammenlignet med et ringlignende, perinukleært mønster i lobulært karcinom (Lehr et al., 2000). I dårligt differentierede adenocarcinomer svarende til den basallignende undertype som defineret ved mikroarray-baseret ekspressionsprofilering af brysttumorer (Sorlie et al., 2001), keratiner, der er karakteristiske for basalcellerne i stratificeret epitel, såsom K5/6, K14 og K17, udtrykkes også. For nylig blev phospho (Ser73)-K8 identificeret som en mulig biomarkør for lavere beclin1-ekspression og dermed defekt autofagistatus i brysttumorer (Kongara et al., 2010).

Keratinekspression er en særlig nyttig vejledning i den korrekte klassificering af nyrecellekarcinomer (Rccs) (Liu et al., 2007), da RCC ‘er med klar celle hovedsageligt udtrykker K8 og K18 med mindre K19-ekspression, udtrykker papillære tumorer stærkt K19 og K7 ud over det grundlæggende K8/K18-par og chromophobe RCC’ er udtrykker typisk K7 og K8/K18, men lidt K19. Godartede oncocytomer kan histologisk ligne chromophobe RCC ‘ er, men er K7-negative (Liu et al., 2007). Overgangscellekarcinomer bevarer generelt det urotheliale keratinmønster, der viser kombineret ekspression af K8/K18, K7 og K19 sammen med K13 og K20 (Moll et al., 1992).

pladecellecarcinomer, uafhængigt af deres oprindelsessted, er kendetegnet ved ekspressionen af de stratificerede epitelkeratiner K5, K14 og K17 og de hyperproliferative keratinocyt-type keratiner K6 og K16 (Moll et al., 2008). K1 / K10 kan også udtrykkes fokalt, og K4 og K13 i mindre grad. I dårligt differentierede pladecellecarcinomer observeres ofte Co-ekspression af de enkle epitelkeratiner K8, K18 og K19.

anvendelse af keratiner som diagnostiske markører i tumorpatologi er langt deres mest almindelige anvendelse inden for kræft. I tilfælde, der forbliver uklare på grundlag af klinisk præsentation og konventionel histopatologi, herunder karcinomer, der er dårligt differentierede eller spreder sig over flere organer og metastaser af ukendt primært tumorsted, keratintyping er især værdifuld til korrekt tumoridentifikation og efterfølgende valg af den mest passende behandlingsplan.

prognostiske markører i epiteltumorer

ud over deres veletablerede rolle som diagnostiske markører i kræft er keratiner også blevet anerkendt som prognostiske indikatorer i en række epiteliale maligniteter (tabel 2). For eksempel har reduceret ekspression af K8 og K20 i kolorektal cancer været forbundet med epitel-til-mesenkymal kræftcelleovergang, hvilket generelt er tegn på højere tumor aggressivitet og nedsat patientoverlevelse (Knosel et al., 2006). Vedvarende eller højere ekspression af et caspase-spaltet K18-fragment ved Asp396 (produceret af apoptotiske epitelceller og detekteret af et epitopspecifikt antistof M30) i serum hos patienter med tyktarmskræft efter primær tumorresektion er tegn på systemisk resterende tumorbelastning og korrelerer signifikant med tilbagefaldsrisiko inden for 3 år (ausch et al., 2009). Højere serumspaltede K18 / M30 niveauer før behandling er også forudsigelige for kortere overlevelse hos lungekræftpatienter (Ulukaya et al., 2007). For nylig undersøges forholdet mellem caspase spaltet (M30) og total K18 (M65), bekvemt bestemt i serum eller plasma ved anvendelse af kommercielt tilgængelige immunosorbentassaysæt, som en biomarkør til overvågning af terapieffektivitet hos karcinompatienter (Linder et al., 2010). Tilsvarende hos patienter med intrahepatisk cholangiocarcinom er en høj serum K19 fragment (CYFRA21-1) koncentration forbundet med nedsat gentagelsesfri og samlet overlevelse (Uenishi et al., 2008). Intratumoral K20-ekspression og K20-positivitet i knoglemarv og/eller blod korrelerer med dårligere prognose i adenocarcinomer i bugspytkirtlen (Soeth et al., 2005; Matros et al., 2006; et al., 2006). Desuden forudsiger kvantitativ revers transkription-polymerasekædereaktion i realtid i gastrisk kræft for K20 i peritoneal skyllevæske peritoneal gentagelse hos patienter, der gennemgår resektion med helbredende hensigt (Katsuragi et al., 2007); K10 og K19 positivitet i hepatocellulære carcinomer er signifikante forudsigere for kortere samlet og sygdomsfri overlevelse efter kirurgisk resektion (Yang et al., 2008); og fravær af pladeforskel som det fremgår af tab af K5/6-ekspression er forbundet med mere aggressive endometriecarcinomer og reduceret overlevelse (Stefansson et al., 2006). I RCC med klar celle er tumoral Co-ekspression af K7 og K19 forbundet med manglen på cytogenetiske ændringer, lav nuklear kvalitet og bedre klinisk resultat., 2008), hvorimod påvisning af K8/18-positive cirkulerende tumorceller korrelerer med positiv lymfeknudestatus, tilstedeværelse af synkrone metastaser på tidspunktet for primær tumorresektion og dårlig samlet overlevelse i nyrecellecancer (Bluemke et al., 2009). Påvisning af disseminerede keratinpositive tumorceller i knoglemarven hos prostatacancerpatienter før operation er en uafhængig risikofaktor for metastase inden for 48 måneder., 2009). Ved hudkræft er keratinekspression i malignt melanom af særlig interesse, da K18 mRNA overraskende identificeres i en tredjedel af melanomvævsprøver og er en negativ prognostisk faktor (Chen et al., 2009).

i brystkræft er den molekylært definerede basallignende subtype karakteriseret ved østrogenreceptor (ER), progesteronreceptor og human epidermal vækstfaktorreceptor-2 negativitet, men epidermal vækstfaktorreceptor og k5 / 6 positivitet, er forbundet med yngre patientalder, høj tumorkvalitet og dårlig prognose, inklusive kortere sygdomsfri og samlet overlevelse (Cheang et al., 2008; Yamamoto et al., 2009). Ekspression af K17 i brysttumorer er også prognostisk for dårligt klinisk resultat, og dette er uafhængigt af tumorstørrelse og kvalitet i node-negativ sygdom (van de Rijn et al., 2002). Påvisning af K19 mRNA-positive cirkulerende tumorceller før adjuverende kemoterapi forudsiger reduceret sygdomsfri og samlet overlevelse hos patienter med er-negativ, triple-negativ og human epidermal vækstfaktorreceptor2-positive tidlige brysttumorer (Ignatiadis et al., 2007), mens tilstedeværelsen af K19 mRNA-positive cirkulerende tumorceller i blodet efter afslutning af adjuverende kemoterapi hos kvinder med tidlig brystkræft af enhver undertype indikerer tilstedeværelsen af kemoterapiresistent restsygdom og er igen forbundet med højere risiko for tilbagefald af sygdommen og nedsat patientoverlevelse (Ksenidis et al., 2009). Genekspressionsprofilering har indikeret, at K18 ofte nedreguleres i metastatisk brystkræft (Hedenfalk et al., 2001; Pernille et al., 2001), et fund forbundet med avanceret tumorstadium og grad, knoglemarvsmikrometastase og kortere kræftspecifik overlevelse og samlet overlevelse (Uldfle et al., 2003, 2004). Også allestedsnærværende immunreaktive nedbrydningsprodukter af K8 og K18 påvises i brystcarcinomer og kan bestemme tumor aggressivitet., 2003).

funktionel rolle i tumorigenese

i betragtning af deres nye regulerende rolle i normal cellefysiologi og deres ofte ændrede ekspression i kræft opstår spørgsmålet om, hvorvidt keratiner spiller nogen funktionel rolle i epithelial tumorigenese. Selvom de fleste keratin KO og transgene mus ikke har nogen tilsyneladende tumorfænotype, resulterer K8-mangel (i FVB-baggrunden) i kolorektal hyperplasi og betændelse (Baribault et al., 1994; Jens et al., 2005), og påvirker også (forkorter) latensen, men ikke forekomsten eller de morfologiske træk ved polyom mellem-T-inducerede brystadenocarcinomer (Baribault et al., 1997); human K8 overekspression resulterer i tidlige neoplastiske lignende ændringer i bugspytkirtlen, herunder tab af acinar arkitektur, dysplasi og øget celleproliferation (Casanova et al., 1999), og korrelerer med omfanget af spontan bugspytkirtelskade (Toivola et al., 2008); og endelig forårsager ektopisk ekspression af K8 i huden epidermal hyperplasi hos unge mus, epidermal atypi og preneoplastiske ændringer i aldrende mus og ondartet progression af godartede hudtumorer induceret af kemiske hudcarcinogeneseanalyser (Casanova et al., 2004).

flere undersøgelser har fremlagt beviser, der understøtter en aktiv keratinrolle i kræftcelleinvasion og metastase. Transfektion af K8 og K18 i mus l-celler, som er fibroblaster og udtrykker vimentin, resulterer i dannelse af keratinfilament og er forbundet med deformerbarhed og højere migrerende og invasive evner, hvilket indikerer, at keratiner kan påvirke celleform og migration gennem interaktioner med det ekstracellulære miljø (Chu et al., 1993). Tilsvarende øger eksperimentel Co-ekspression af vimentin og K8/K18 invasion og migration af humant melanom (Chu et al. 1996) og brystkræft (Hendrik et al., 1997) celler in vitro.

inkubation af humane pancreascancerceller med sphingosylphosphorylcholin, et bioaktivt lipid til stede i lipoproteinpartikler med høj densitet og fundet ved forhøjede niveauer i blodet og maligne ascites fra ovariecancerpatienter, inducerer keratinreorganisering til en perinuklear, ringlignende struktur, der ledsages af K8 og K18 phosphorylering ved henholdsvis ser431 og Ser52 (Beil et al., 2003). Denne ændring i keratinnetværksarkitekturen resulterer i øget cellulær elasticitet og forbedret cellemigration, hvilket indikerer, at sphingosylphosphorylcholin-induceret keratinomdannelse direkte kan bidrage til det metastatiske potentiale i epitelcancerceller (Suresh et al., 2005). Celledeformerbarhed øges også i forbindelse med keratinnetværksændringer på grund af sphingosylphosphorylcholin, hvilket sandsynligvis resulterer i større kræftcelleevne til at invadere det omgivende væv og trænge igennem stroma og dermed lette dets flugt fra den primære tumor (Rolli et al., 2010). Desuden har det seneste arbejde impliceret ændringer i keratinphosphorylering som en medvirkende faktor til kolorektal cancer progression, da K8 er et fysiologisk substrat af phosphatase af regenererende lever-3, som er kendt for at fremme invasivitet og metastatisk potentiale af kolorektal cancerceller og høj phosphatase af regenererende lever-3 niveauer er forbundet med reduktion eller tab af phosphoryleret K8 på den invasive front af humane kolorektal cancer prøver og i levermetastaser., 2009).

flere undersøgelser har undersøgt keratins rolle i kræftcelleinvasion ved at undersøge K8-medieret plasminogenaktivering til serinproteasen plasmin, som er involveret i ekstracellulær matrice remodeling og som sådan i tumorprogression og metastase. Plasminogen aktiveres på celleoverfladen af urokinase-typen plasminogenaktivator bundet til urokinase-typen plasminogenaktivatorreceptor og det C-terminale domæne af K8, der trænger ind i den cellulære membran (K8 ektoplasmisk domæne), som vist i hepatocellulære og brystcarcinomceller (Hembrough et al., 1995). Selvom det er usandsynligt, at keratin gør det til celleoverfladen gennem den regelmæssige sekretoriske vej (Riopel et al., 1993), et monoklonalt antistof mod K8 ektoplasmisk domæne forhindrer urokinase-type plasminogenaktivatorbinding og hæmmer plasmin generation, hvilket igen resulterer i ændret cellemorfologi, større celleadhæsion til fibronectin og Reduceret potentiale for brystkræftcelleinvasion (Obermajer et al., 2009), hvilket indikerer, at K8 sammen med urokinase-type plasminogenaktivator, plasminogen og fibronectin danner en signalplatform, der kan modulere celleadhæsion og invasivitet af brystkræftceller.

K18 kan spille en regulerende rolle i hormonelt responsiv brystkræft, da den effektivt kan associeres med og sekvestrere ERa-målgenet og ERa-coaktivator LRP16 i cytoplasmaet og dermed dæmpe ERa-medieret signalering og østrogenstimuleret cellecyklusprogression i brysttumorceller (Meng et al., 2009). Desuden er autofagi defekter, som fremmer brysttumorigenese., 2007), resulterer i K8, K17 og K19 opregulering i musembrysttumorceller under metabolisk stress in vitro og i allograft musembrysttumorer in vivo (Kongara et al., 2010), potentielt implicerende deregulering af keratinhomeostase i defekt autofagi-associeret brystkræft, en hypotese, der er værdig til yderligere undersøgelse. Defekt autofagi er også blevet impliceret i unormal keratinakkumulering i leveren, da Mallory–denk kropslignende inklusionsdannelse, som er et almindeligt fund i hepatocellulære carcinomer, påvirkes direkte af farmakologisk autofagimodulation (Harada et al., 2008).

Keratin 17, som hurtigt induceres i såret stratificeret epithelia, regulerer cellestørrelse og vækst ved at binde til adapterproteinet 14-3-3 liter og stimulere mTOR-vejen og således regulere proteinsyntese (Kim et al., 2006). Yderligere bevis for, at keratiner kan fungere opstrøms for mTOR, tilvejebringes ved studier på mus med ablation af alle keratingener, hvor embryonal dødelighed fra svær væksthæmning er forbundet med afvigende lokalisering af glukosetransportørerne GLUT1 og GLUT3m, hvilket resulterer i adenosinmonophosphatkinase aktivering og undertrykkelse af mtorc1 nedstrøms mål S6 kinase og 4e-BP1 (vijayaraj et al., 2009). I et tilsyneladende gensidigt forhold regulerer AKT-isoformer mellemliggende filamentekspression i epitelcancercellelinjer, da overekspression af AKT1 øger K8/K18 niveauer og AKT2 opregulerer K18 og vimentin (Fortier et al., 2010). Således interagerer keratiner, som ofte udtrykkes aberrantly i epitelcancer, på flere måder med AKT/mTOR-vejen, som i sig selv ofte aktiveres unormalt i aggressive tumorer, hvilket øger muligheden for, at Akts rolle i epiteltumorigenese i det mindste delvist er keratinmedieret og/eller afhængig.

keratiner er også vigtige for chaperonmedieret intracellulær signalering, som igen kan spille en rolle i epithelial tumorigenese. Atypisk PKC er en evolutionært bevaret nøgleregulator for cellulær asymmetri, som også er blevet identificeret som en onkogen årsag til ikke-småcellet lungekræft og en prædisponerende faktor for tyktarmskræft, når den er overudtrykt (Fields and Regala, 2007). Nyligt arbejde viste, at både filamentøse keratiner og varmechokprotein 70 er nødvendige til redningsrephosphorylering af modent atypisk PKC, hvilket regulerer dets subcellulære fordeling og opretholder dets steady-state niveauer og aktivitet (Mashukova et al., 2009). I betragtning af et overskud af opløseligt varmechokprotein 70 forventedes keratinnetværket desuden at være et hastighedsbegrænsende trin i den atypiske PKC-redningsmekanisme, en hypotese bekræftet i to forskellige K8-overekspressionsdyrmodeller (Mashukova et al., 2009). I begge tilfælde udviste cellulære regioner med unormal og overdreven mellemliggende filamentakkumulering også groft forkert lokaliseret aktivt atypisk PKC-signal, hvilket indikerer, at chaperone-assisteret onkogen kinaseaktivitet, inklusive Akt1, også kan afhænge af keratiner og udvide den allerede tilgængelige viden om keratins rolle som chaperone stilladser (van den et al., 1999; Toivola et al., 2010).

selvom K8-mutationer er blevet impliceret i progressionen af akut og kronisk (Ku et al., 2001) leversygdom, de har ikke været direkte forbundet med hepatocellulær, bugspytkirtel (Treiber et al., 2006) eller ethvert andet karcinom. Til dato er den eneste keratin-og tumortype, for hvilken en specifik variant eller enkeltnukleotidpolymorfisme har været forbundet med kræftprædisponering, K5 i basalcellekarcinom (Stacey et al., 2009), som en genom-dækkende enkeltnukleotidpolymorfism associeringsscanning for almindelige basalcellekarcinomrisikovarianter identificerede g138e-substitutionen i K5 som en modtagelighed for basalcellekarcinom, men ikke for pladecellecarcinom, kutant melanom eller fair-pigmentering træk. I betragtning af det stigende antal genomdækkende associeringsundersøgelser for forskellige kræftformer er det muligt, at yderligere keratinvarianter, der påvirker specifik kræftrisiko, kan opdages i den nærmeste fremtid.

rolle i lægemiddelresponsivitet

keratiner beskytter epitelceller mod mekanisk stress, men giver også resistens over for andre cellulære stressorer, der kan føre til celledød, herunder dødsreceptoraktivering og kemoterapeutiske lægemidler. For eksempel K8-og K18-null-mus, der mangler keratinmellemfilamenter i deres hepatocytter på grund af keratininstabilitet, når partnerkeratin mangler, og hepatocytter dyrket eks vivo fra K8-null-mus er mere følsomme over for Fas-medieret apoptose end deres vilde modstykker (Gilbert et al., 2001). Tilsvarende disponerer en K18 – mutation (Arg89Cys), der forstyrrer keratinfilamentnetværket, hepatocytter til Fas-men ikke tumornekrosefaktormedieret apoptotisk skade (Ku et al., 2003b). Disse fund viser tydeligt, at K8 og K18 medierer resistens over for Fas-induceret apoptose i leveren; de kan dog også være relevante for kræftbehandling, da keratinniveauer påvirkes af kræftlægemidler, såsom Cress et al., 1988) og Doksorubicin (Hammer et al., 2010), og proapoptotiske receptoragonister kan have selektiv antitumoraktivitet, da aktivering af den ydre apoptotiske celledødsvej ved binding af apoptose ligand 2/tumornekrosefaktorrelateret apoptoseinducerende ligand til beslægtet dødsreceptorer resulterer i apoptose af forskellige cancercelletyper uden signifikant toksicitet over for normale celler (Ashkenasi, 2008, 2010).

Aberrant keratin expression has already been shown to confer a multidrug resistance phenotype, as mouse L fibroblasts are rendered resistant to MX, doxorubicin, methotrexate, melphalan and vincristine, but not to ionizing radiation, upon K8 and K18 transfection (Bauman et al., 1994). Similarly, NIH 3T3 fibroblasts with ectopic K8/K18 expression exhibit resistance to MX, doxorubicin, bleomycin, mitomycin C and melphalan, but not to cisplatin (Anderson et al., 1996). Desuden udviser monocytkemoattraktantprotein-7 / MKS, en MKS-valgt human brystkræftcellelinie med en multidrugresistent fænotype på grund af overekspression af det brystkræftresistente protein, også forhøjede K8-niveauer, som synergiserer med brystkræftresistent protein i stigende lægemiddelresistens, sandsynligvis virker via forskellige mekanismer, som anti-K8 kort hårnål RNA reverserer MKS-resistens uden at fremme intracellulær lægemiddelakkumulering som brystkræftresistent proteinnedslag gør (Liu et al., 2008b). Multidrugresistensen af monocytkemoattraktantprotein-7 / MKS-celler skyldes i det mindste delvist deres øgede vedhæftning til den ekstracellulære matrice, som igen medieres af K8-ekspression på celleoverfladen, hvilket indikerer, at ændringer i ekspressionsniveauet og cellulær lokalisering af K8 aktivt kan nedsætte responsen på kræftbehandling (Liu et al., 2008a). Hvorvidt farmakologisk keratinmodulation kan bruges som et supplement til kemoterapi til forbedring af terapeutiske resultater skal stadig undersøges.