lithiumchlorid dræber effektivt honningbi-parasitten Varroa destructor ved en systemisk virkemåde
pilotundersøgelse: fra RNAi til lithiumchlorid
i en pilotundersøgelse blev mide-inficerede honningbier bur og fodret saccharosesirup indeholdende dsRNA ‘ er af potentielt essentielle Varroa-gener (supplerende tabel S1). Almindelig saccharosesirup (ubehandlet) og sirup med dsRNA baseret på kodningssekvensen for det grønne fluorescerende protein GFP (dsgfp ctrl) tjente som kontroller. GFP er udtrykt i bioluminescerende vandmænd Aekvorea victoria. GFP-sekvensen blev valgt som en kontrol, fordi der ikke findes noget homologt gen i genomet af honningbier eller varroamiden. I den ubehandlede gruppe var mitedødeligheden < 5%. I modsætning hertil blev alle mider på bier, der modtog saccharoseopløsning indeholdende dsRNA rettet mod Varroa-gener, effektivt dræbt inden for tre dage. En identisk effekt på mider blev imidlertid observeret i et kontroleksperiment, hvor bier blev fodret med GFP dsRNA (supplerende Fig. S1). Disse resultater udelukkede den foreslåede RNAi-medierede mekanisme, men antydede enten en endnu ukendt effekt af RNA eller aktiviteten af andre komponenter i testopløsningen. Da høje koncentrationer af lithiumchlorid (LiCl) blev brugt til produktion af dsRNA ‘ er og derfor fodret til bierne sammen med dsRNA, valgte vi at fodre LiCl i saccharoseopløsning til burbier for at teste dens aktivitet mod varroamider. Påfaldende dræbte LiCl i koncentrationer på 25 mM, hvilket svarer til den beregnede koncentration i dsRNA-opløsningen, miderne lige så effektivt som teststofferne indeholdende dsRNA. Desuden, efter at LiCl stort set blev fjernet fra dsRNA ved omfattende vask (vasket dsgfp ctrl), blev den miticidale aktivitet væsentligt formindsket som indikeret ved forsinket indtræden og reduceret aktivitet (supplerende Fig. S1). Ud fra disse data konkluderede vi, at LiCl, ikke RNA-nedslag, medierede den observerede aktivitet på varroamider, og at det ville være værd at analysere potentialet for LiCl som et varroacid.
effektiv koncentration af lithiumchlorid
for at bekræfte de primære observationer af vores pilotundersøgelse etablerede vi bureksperimenter med forskellige koncentrationer af LiCl til robust statistisk analyse. Ud over 25 mM koncentrationen, som viste sig at være effektiv i pilotundersøgelsen, brugte vi koncentrationer på 2 mM, 4 mM og 10 mM for at bestemme den lavere tærskel for effektivitet. Resultaterne understøttede resultaterne fra den tidligere undersøgelse og viste signifikante miticidale virkninger for LiCl-koncentrationer så lave som 2 mM, hvor en betydelig stigning i midedødelighed (P < 0,001, log-rank test; supplerende tabel S2) blev vist. Højere koncentrationer på 10 mM og 25 mM forbedrede begge midedødeligheden markant fra dag to af behandlingen og opnåede udryddelse af mere end 96% af de behandlede mider ved afslutningen af eksperimentet (Fig. 1a, supplerende tabel S2). I kontrolforsøgene uden LiCl i fodringsopløsningen nåede midedødeligheden i gennemsnit 9,3% og lå derfor godt inden for det dødelighedsområde, der blev opnået for mider, der blev holdt på ubehandlede burbier under forskellige miljøforhold33. Baseret på disse resultater bekræftede vi en klar effekt af LiCl på mide levedygtighed i et koncentrationsområde mellem 2 mM og 25 mM.
mortalitet af phoretic varroamider og honningbier efter fodring af lithiumchlorid (LiCl) til burbier. a) Kaplan-Meier–overlevelseskurve for varroamider, der holdes på burbier fodret med LiCl i koncentrationer mellem 2 mM-25 mM (n = 33, 9, 9, 12 og 9 bure for henholdsvis 0 mM (kontrol), 2 mM, 4 mM, 10 mM og 25 mM). Ved alle koncentrationer var overlevelsen af mider i behandlingsgrupperne signifikant forskellig fra kontrollen (P < 0,001, log-rank test med Bonferroni korrektion). B) Kaplan-Meier-overlevelseskurven for burarbejderbier og varroamider efter 24 timers eksponering for LiCl (n = 9 bure). Overlevelsen af mider i behandlingsgruppen var signifikant forskellig fra kontrolgruppen (P < 0,001, log-rank test), men der var ingen signifikante gruppeforskelle i bi-dødelighed.
i disse forsøg blev de burede bier fodret med den respektive koncentration af LiCl over flere dage, indtil alle mider blev dræbt ved behandlingen. For potentiel anvendelse i biavlspraksis ville en kortere og defineret behandlingsperiode imidlertid være at foretrække. Vi udførte derfor et yderligere eksperiment, hvor den mest effektive koncentration på 25 mM LiCl (Fig. 1a) blev administreret i 24 timer efterfulgt af fodring med sukkeropløsning i yderligere seks dage. I slutningen af observationsperioden, 92.9% af miderne (n = 225 mider, P < 0,001, log-rank test) blev dræbt uden nogen signifikant effekt på de behandlede bier (se næste afsnit). Dette resultat viser tydeligt, at selv en kortvarig fodring af 25 mM LiCl er tilstrækkelig til væsentligt at mindske midepopulationen.
for nøjagtigt at bestemme den indtagne mængde LiCl af bierne, der er nødvendig for at dræbe parasiterende mider, blev 12 nyklækkede bier kunstigt fodret 10 liter LiCl-opløsninger på 4 mM til 100 mM og holdt individuelt med en phoretisk mide i fem dage i bur. Med 4 mM-og 10 mM-opløsningerne, som svarede til en optagelse på henholdsvis 1,7 liter og 4,2 liter LiCl, var effekten ikke signifikant forskellig fra den ubehandlede Kontrol (n = 12 mider, P = 1.000, log-rank-test, supplerende tabel S3). En enkelt dosis på 25 mM, svarende til 10,6 liter LiCl forbrugt af bien, var imidlertid tilstrækkelig til at dræbe 100% af de phoretiske mider inden for 48 timer (Fig. 2).
dødelighed af phoretiske varroamider holdt på bier, der blev fodret individuelt 10 liter af en lithiumchloridopløsning i koncentrationer fra 4 mM til 100 mm. bierne blev kun fodret licl en gang i begyndelsen af eksperimentet, derefter modtog de saccharosesirup over fem dage. For hver koncentration blev 12 bure med en bi og en varroamide hver analyseret. Overlevelsen af mider blev signifikant reduceret sammenlignet med kontrolgruppen, når koncentrationer på 25 mM og højere blev fodret til bierne (P < 0,001, log-rank test).
effekt på arbejderbier
til analyse af tolerabiliteten af LiCl til arbejderbier, de testbure, der blev brugt til at analysere midedødelighed (Fig. 1a) blev desuden registreret for dødeligheden af arbejderbierne. Efter eksponering for 2 mM, 10 mM og 25 mM LiCl, som har vist sig at udøve miticidaktivitet, varierede den behandlede arbejderbidødelighed i gennemsnit fra 3 til 7% inden for de forskellige fodringsgrupper. Med undtagelse af 10 mM LiCl-gruppen (n = 12 bure, P = 0,015, log-rank test; supplerende tabel S4) var værdierne ikke signifikant forskellige fra 4% mortaliteten i den ubehandlede kontrolgruppe. Desuden var dødeligheden af vores kontroller langt inden for området for dødeligheden af ikke-behandlede burbier, der kræves som kontrol i toksikologiske test34, hvilket bekræfter gyldigheden af vores testsystem. Også 24 h-behandlingen med LiCl påvirkede ikke dødeligheden af arbejderbier (Fig. 1b; n = 9 bure, P = 0,308, log-rank test). En god tolerance for LiCl til bier blev også bekræftet ved fodring af en enkelt dosis (for midedødelighed se Fig. 2) der ikke fremkaldte en signifikant stigning i arbejderbidødeligheden (P = 1.000, log-rank test; supplerende tabel S5).
dernæst blev forskellige koncentrationer af LiCl kontinuerligt fodret, indtil den sidste burbi døde for at undersøge respons på langvarig eksponering. Her reducerede behandlingen signifikant den gennemsnitlige levetid for nyklækkede arbejderbier fra 26 dage i de ubehandlede kontrolbure til 23 og 22 dage for henholdsvis 2 mM og 10 mM LiCl (n = 60 bier, P = 0,024, log-rank test; supplerende tabel S6). Hos bier, der fik den højeste koncentration på 25 mM LiCl, blev levetiden signifikant reduceret til 19 dage i gennemsnit (Fig. 3a).
dødelighed af honningbier efter fodring af lithiumchlorid til burbier. (a) Kaplan-Meier overlevelseskurve for bur arbejderbier under kronisk LiCl eksponering. LiCl-diæter i koncentrationer på 2 mM, 10 mM og 25 mM blev fodret ad libitum indtil den sidste bies død (n = 6 bure med 10 bier hver). Overlevelsen af alle behandlede grupper var signifikant forskellig fra sukkersirupkontrollen (P < 0,01, log-rank test med Bonferroni korrektion). B) Kaplan-Meier-overlevelseskurven for burarbejderbier efter en eksponering på 24 timer. LiCl-diæter i koncentrationer på 2 mM, 10 mM og 25 mM blev fodret ad libitum i de første 24 timer efter udklækning og derefter erstattet af saccharosesirup (n = 12 bure med 10 bier hver). Overlevelsen af alle behandlede grupper var ikke signifikant forskellig fra sukkersirupkontrollen (P > 0,1, log-rank test med Bonferroni korrektion).
LiCl synes dog kun at hæmme biernes levedygtighed, hvis det administreres over en længere periode som angivet ved et yderligere forsøg, hvor LiCl blev fodret i de første 24 timer efter klækning og derefter blev erstattet af saccharosesirup, indtil den sidste burbi døde (Fig. 3b). Her varierede den gennemsnitlige levetid for nyklækkede arbejderbier fra 22 dage (10 mM) til 24 dage (kontrol) uden signifikante forskelle mellem behandlingerne (n = 120 bier pr. Baseret på disse data fra burbier konkluderer vi, at selv en kortvarig LiCl-behandling er tilstrækkelig til fuldstændigt at udrydde varroamideangreb med ringe eller ingen indflydelse på levedygtigheden af arbejderbier. Disse resultater opnået i burtest under kontrollerede forhold repræsenterer et vellykket og lovende første skridt mod en ny tilgang til Varroa-behandling. Effektivitet og bivirkninger skal dog bekræftes under feltforhold.
feltforsøg med lithiumchlorid i kunstige sværme
til omtrentlige feltforhold testede vi 25 mM og 50 mM LiCl i ni kødfrie kunstige sværme bestående af en dronning og cirka 20.000 bier hver. Disse koncentrationer blev valgt ud fra tidligere forsøg med burbier ved anvendelse af den højeste dosis, der stadig blev tolereret af bier i korte påføringstider (25 mM). Da en jævn fordeling af saccharosesirup gennem hele den kunstige sværm på cirka 20.000 bier kunne have været vanskelig at opnå, testede vi desuden en 50 mM koncentration af LiCl for at sikre, at hver bi blev udsat for tilstrækkelige mængder lithium. Sværmene blev følgelig fodret ad libitum med saccharosesirup indeholdende 25 mM LiCl (n = 6) eller 50 mM (n = 3) i en periode på tre dage efterfulgt af en topisk påføring af Perisinchur. Det er et meget effektivt varroacid, der almindeligvis anvendes som kontrolbehandling35. Midedødeligheden blev overvåget over en periode på fem dage. Før kontrolbehandlingen dræbte 25 mm LiCl ca.90% af miderne i de kunstige sværme (tabel 1). Den højere koncentrerede opløsning (50 mM) forøgede imidlertid ikke denne effekt (prist2-test, P = 0,953). Samlet set var effekten noget lavere sammenlignet med cage-testene. En forklaring kan være, at fordelingen af LiCl inden for en klynge af tusinder af bier kræver mere tid, indtil den sidste individuelle bi bruger en tilstrækkelig dosis til at dræbe den respektive parasiterende mide. Den nødvendige fodringstid for så store enheder på 20.000 bier og mere skal analyseres i yderligere forsøg.
effektivitet af andre lithiumforbindelser og ikke-lithiumsalte
for at bekræfte lithium som den aktive komponent til effekten på varroamider testede vi en række lithiumforbindelser og sammenlignede de miticidale virkninger med ikke-lithiumsalte. Af særlig interesse var lithiumcitrat, en forbindelse med tre lithiumioner, lithiumsulfat og lithiumcarbonat, som har to lithiumioner sammenlignet med kun en lithiumion i LiCl. Yderligere forbindelser med en lithiumion (lithiumlactat, lithiumacetat), men forskellig opløselighed, kemisk reaktivitet og pris blev inkluderet for at analysere effektivitet og tolerabilitet sammenlignet med LiCl. I bureksperimenter eliminerede alle forbindelser 100% af miderne ved 25 mM inden for tre (lithiumcitrat og lithiumacetat) til fire dage (lithiumsulfat, lithiumlactat og lithiumcarbonat). Også de 4 mM testopløsninger dræbte helt phoretiske mider inden for fem (lithiumcitrat, lithiumsulfat og lithiumacetat) til syv dage (lithiumlactat) undtagen lithiumcarbonat (tabel 2; supplerende tabel S8).
arbejderbidødeligheden blev ikke signifikant øget ved nogen af koncentrationerne sammenlignet med de ubehandlede kontrolbier, bortset fra 25 mM lithiumsulfat og 25 mM lithiumlactat (supplerende tabel S9). Med disse eksperimenter kunne vi bekræfte, at andre lithiumforbindelser har et lignende potentiale til anvendelse som et systemisk acaricid. Dette kan øge fleksibiliteten for den mulige udformning af et veterinærprodukt. I betragtning af prisen er lithiumchlorid og lithiumcitrat de billigste forbindelser. Lithiumsulfat er mindre egnet på grund af den lavere bi-tolerance og lithiumcarbonat på grund af en relativt lav vandopløselighed.
for at undersøge den koncentrationsafhængige effekt af lithiumforbindelser mere detaljeret sammenlignede vi LiCl med lithiumcitrat (Li3C6H5O7), som havde den største forskel i antallet af lithiumioner pr. Alle koncentrationer af lithiumcitrat udviste signifikant højere acaricid aktivitet sammenlignet med LiCl, men der var ingen forskel i dødeligheden af bierne (tabel 3, supplerende tabeller S9 og S11). Derfor kan lithiumcitrat repræsentere en endnu bedre aktiv ingrediens.
som en lithiumfri kontrol og for at udelukke chlorid som et aktivt middel testede vi også de alkaliske salte natriumchlorid (NaCl) og kaliumchlorid (KCl) og også magnesiumchlorid (MgCl) ved 25 mM. Vi observerede ikke en varroacidal virkning for NaCl eller KCl (n = 3 bure, P = 1.000, log-rank test, supplerende tabel S12). I test med MgCl døde 100% af de burede bier inden for fem dage (P < 0.001, log-rank test), og i henhold til det faldende antal bier blev eksperimentet afsluttet, før effekten på mider kunne analyseres. Baseret på disse eksperimenter konkluderede vi, at lithium faktisk formidler acaricid aktivitet på en dosisafhængig måde, og at lithiumcitrat udviser de mest gunstige egenskaber for alle forbindelser, der hidtil er testet.
potentiale for lithiumforbindelser som nyt varroacid
Vi har vist, at ikke de oprindeligt hypotetiske dobbeltstrengede RNA ‘ er mod essentielle Varroa-gener, men overraskende formidler lithiumsalte en stærk akaricid virkning på varroamider på burbier og i kunstige sværme. Disse resultater viser således, at lithiumforbindelser repræsenterer en ny klasse af acaricide midler med et enestående potentiale og bemærkelsesværdigt god tolerabilitet af bier. Den forskellige følsomhed hos mider og bier over for LiCl er endnu mere bemærkelsesværdig i betragtning af, at koncentrationen af LiCl i biernes hæmolymph på grund af fortyndingseffekter sandsynligvis vil være væsentligt lavere end den koncentration, der fodres til bierne.
det er vigtigt, at vores fund ikke indebærer, at akaricide virkninger af RNAi-baserede tilgange som offentliggjort af Garbian et al.32 er generelt medieret af LiCl. Efter fodring af en blanding af dsRNA til honningbier over en periode på 60 dage, Garbian et al.32 registrerede en langsom stigning i midedødelighed med en endelig behandlingseffektivitet på kun 60%. I betragtning af den hurtige og meget effektive reaktion fra vores kunstige sværme på behandlinger med LiCl, forskellige virkningsmåder er sandsynlige: mens RNAi-medierede Effekter ser ud til at udøve langtidseffekter, lithiumforbindelser repræsenterer en uafhængig mekanisme med hurtig indtræden og høj effektivitet.
som varroacid viser LiCl nogle funktioner, der er unikke i denne kombination: (i) LiCl virker systemisk via honningbi-fodring (“let at anvende”), (ii) Det er vandopløseligt og vil derfor ikke ophobes i bivoks,hvilket er et afgørende problem for langtidsbehandlingskoncepter ved anvendelse af syntetiske varroacider med lipofile egenskaber36, 37 (iii) den orale toksicitet af de fleste lithiumforbindelser til pattedyr er relativt lav38 (iv) Det har ingen frastødende virkning på fodringsopløsningen inden for det relevante koncentrationsinterval på 2-25 mM39 og (v) det er tilgængeligt til moderate priser. Meget lovende er det faktum, at en enkelt påføring af kun 10 liter LiCl i en 25 mM opløsning (svarende til en dosis på 10,6 liter LiCl) pr. En udfordring for yderligere forskning vil være udviklingen af en smart applikationsteknik til sværme og kolonier i fuld størrelse for at sikre, at alle bier får den kritiske mængde af den aktive forbindelse.
i øjeblikket ved vi ikke, hvordan LiCl dræber de phoretiske varroamider, og der er få publikationer om effekten af LiCl i insekter40. I humanmedicin er lithium blevet brugt siden 1870 ‘ erne og er et humørstabiliserende middel, der er indiceret til behandling af maniske episoder og som vedligeholdelsesbehandling for bipolar lidelse41. I betragtning af deres terapeutiske anvendelse er lithiumforbindelser og deres toksicitetsprofil blevet undersøgt omhyggeligt. Indtil videre er der blevet foreslået en række stoffer, der virker på metabolisme, udvikling,hæmatopoiese og andre processer som potentielle mål42, 43. Disse stoffer kræver metalioner, og lithium udøver sin aktivitet på en ikke-konkurrencedygtig måde, hvilket sandsynligvis forekommer ved at fortrænge en divalent kation. Ganske vist har vi i øjeblikket ingen indikation af, at den observerede miticidale virkning af lithiumforbindelser er afhængig af en sammenlignelig virkningsmåde.
Vi er også opmærksomme på, at vores resultater Kun repræsenterer det første skridt i retning af udvikling af et nyt veterinærprodukt. Feltforsøg i fritflyvende kolonier er lige så nødvendige som analyse af subletale og langsigtede bivirkninger på voksne bier og honningbiavl og mulige restproblemer i honning.
de resultater,der præsenteres her, indikerer imidlertid allerede, at LiCl har potentiale som en effektiv og let at anvende behandling for kunstige og naturlige sværme og især for det enorme antal pakkebier, der anvendes til bestøvning i Usa11, 44. Desuden kan en præcisering af virkningsmekanismen åbne nye muligheder for målrettet udvikling af veterinærprodukter til bekæmpelse af varroamider.