PMC

dobbeltstrengede brud i DNA kan skabe kaos i celler, hvis de ikke repareres. Derfor blev det foreslået, at enderne af kromosomer kan være specialiserede hættestrukturer, der ikke anerkendes som dobbeltstrengede brud, hvilket forhindrer cellecyklusstop, nedbrydning og rekombinational fusion (Muller, 1938; McClintock, 1939). Vi ved nu, at telomerer omfatter enderne af kromosomer og er afgørende for genomstabilitet. Telomerer er sammensat af tandem head-to-tail gentagelser af en kort G-rig sekvens; for eksempel er menneskelige telomerer 2-20 kb (TTAGGG)n gentagelser. Kromosomenderne er ikke stumpe, og 3′-enden (G-rig streng) hænger ud i en enkelt streng, der kan invadere det indre af telomeren for at fortrænge den indre G-rige sekvens og danne en T-loop-struktur (Griffith et al., 1999; Cesare et al., 2003; Doksani et al., 2013), således at kromosomenderne beskyttes mod at blive genkendt af cellen som dobbeltstrengbrud, ud over beskyttelse af proteiner, der binder telomeren.

eukaryote kromosomer duplikeres via semikonservativ replikation med en førende (kontinuerlig syntese til nettovækst ved 3′ – enden af den spirende førende streng) og tilbagestående (diskontinuerlig okasaki-fragmentsyntese til nettovækst ved 5′ – enden af den spirende tilbagestående streng) forlængende streng som vist i Fig. 1. Ved kromosomal semikonservativ replikation fjernes den korte 5 ‘ RNA-primer fra den spirende streng, og spalten udfyldes af DNA, der ligeres til det tilstødende spirende DNA. I slutningen af kromosomet kan spalten efter fjernelse af den 5’ terminale RNA-primer på den tilbagestående streng imidlertid ikke udfyldes, og kromosomet kan blive kortere med hver efterfølgende replikationsrunde. Dette er blevet kaldt slutreplikationsproblemet (1972; Olovnikov, 1973), og telomerase hjælper med at løse dette problem (Greider og Blackburn, 1987; Soudet et al., 2014).

Semikonservativ replikation forekommer før virkningen af telomerase. Tidligere blev det antaget, at DNA-replikation begyndte med en oprindelse i kromosomalt DNA ved siden af telomer-gentagelserne, hvor replikationsgaflerne bevægede sig tovejs væk fra den subtelomere Oprindelse (Fig. 1 a), således replikerer telomeren. Spørgsmålet forblev imidlertid, om DNA-replikation kunne initiere med en vis frekvens inden for selve telomeren (Fig. 1 B). Dette spørgsmål er nu blevet besvaret bekræftende i dette nummer af Drosopoulos et al., der brugte enkeltmolekylanalyse af replikeret DNA (SMARD; Norio og Schildkraut, 2001). I denne tilgang mærkes replikerende celler sekventielt af to forskellige nukleotidanaloger, der efterfølgende identificeres ved immunofluorescens. For eksempel i tovejsreplikation flankeres røde signaler fra den første puls i hver ende af grønne signaler fra den anden puls. Tidligere rapporter ved hjælp af SMARD havde konkluderet, at de fleste replikationer initieres i subtelomere regioner i musen og det menneskelige genom og sjældent i telomerer selv (Sfeir et al., 2009; Drosopoulos et al., 2012). I den nylige undersøgelse foretaget af Drosopoulos et al. (2015), fluorescens in situ hybridisering (fisk) ved hjælp af prober fra telomerregionen tillod replikationsmønsteret at blive analyseret for et 320 kb genomisk segment fra slutningen af musens kromosomarm 14K. på grund af den lange tid (4 timer) for den første (røde) puls blev der normalt kun set røde signalkanaler inden for telomeren, men da mange sådanne molekyler ikke havde det røde signal strækker sig ind i det subtelomere område, kan det komfortabelt konkluderes, at replikation skal have indledt inden for telomeren (Fig. 1 B). Desuden havde nogle molekyler rødt signal i telomeren flankeret af grønt signal, hvilket understøtter denne konklusion. Selvom der i disse tilfælde var kromosom-proksimalt grønt signal, blev kromosom-distalt grønt signal sjældent set. Selvom der således var begrænset bevis for tovejsreplikation med oprindelse i telomeren, er det meget klart, at en replikationsoprindelse kan eksistere inden for selve telomeren med en replikationsgaffel, der strækker sig over tid ind i subtelomeren. Det skal undersøges, om replikation initierer med en relativt høj frekvens i telomerer af andre kromosomer end 14k.

disse fund rejser spørgsmålet om, hvorvidt oprindelsen til DNA-replikation falder sammen med den enkle sekvensreplikation, der findes i telomerer, eller i stedet, hvis den falder sammen med en anden sekvens, der kan være ispedd i telomeren. Førstnævnte foreslås af en undersøgelse med Ksenopus cellefri ekstrakter, der kunne samle præreplikationskomplekset og gennemgå en vis DNA-replikation på eksogent DNA, der udelukkende indeholder telomere gentagelser (Kurth og Gautier, 2010). Lignende konklusioner, som DNA-replikation kan initiere i de enkle DNA-gentagelser, der findes i centromerer, hvor replikationsbobler er blevet observeret i Drosophila virilis ved elektronmikroskopi, er nået (1976), og en nylig undersøgelse antyder, at DNA-replikation initierer inden for humant alfa-satellit-DNA (erliandri et al., 2014).Replikationsgafler bevæger sig langsomt gennem telomer DNA (Ivessa et al., 2002; Makovets et al., 2004; Miller et al., 2006; Sfeir et al., 2009) på grund af den høje termiske stabilitet af GC-rig telomer DNA såvel som dets tilbøjelighed til at danne stabile sekundære strukturer, såsom G-firdobbelt (G4) DNA, som kan udgøre problemer for DNA-replikation (Lopes et al., 2011; Paeschke et al., 2011). Forskellige helikaser hjælper med at løse dette problem; for eksempel hjælper Pif1 helicase med at slappe af G4 (Paeschke et al., 2013). Bloom syndrome helicase (BLM) er også blevet impliceret i at hjælpe telomerreplikation: BLM undertrykker replikationsafhængige skrøbelige telomerer (Sfeir et al., 2009), og VN undertrykker defekter i telomer halter streng syntese (Crabbe et al., 2004). Drosopoulos et al. (2015) rapporterer nu, at førende strengsyntese, der initierer inden for telomeren, har en langsommere progressionshastighed i subtelomeren i BLM-mangelfulde celler som visualiseret af SMARD. Desuden var der en højere frekvens af replikationsinitiering i 14K-subtelomeren af de BLM-mangelfulde celler, der stammer tættere på telomeren end i BLM-dygtige celler. Disse observationer antyder, at hvilende replikationsoprindelse i 14K-subtelomeren kan aktiveres, når gaffelprogression hindres i BLM-mangelfulde celler (Fig. 1 C). Drosopoulos et al. (2015) fandt også en stigning i subtelomer replikationsinitiering, da replikationsgaffelprogression fra telomeren blev forhindret af bladlus, som et alternativt middel til at aktivere sovende Oprindelse ved replikationsstress. Når celler blev behandlet med G4 stabilisator PhenDC3, 14k subtelomer Oprindelse fyring steg yderligere i BLM-mangelfulde celler. Samlet antyder dataene en afmatning af progressionen af førende strengsyntese fra en oprindelse i 14K telomer (ved hjælp af den G-rige forældrestreng som skabelon), når G4-strukturer ikke kan løses i BLM-mangelfulde celler. Som yderligere understøttelse af en rolle af BLM helicase til fjernelse af G4-strukturer var der øget farvning i BLM-mangelfulde celler af BG4-antistoffet (Biffi et al., 2013) mod G4 i hele genomet og især i telomerer.helicase kan slappe af G4 in vitro (Fry and Loeb, 1999; Mohaghegh et al., 2001). Når Drosopoulos et al. (2015) brugte SMARD til at analysere replikation i celler dobbelt mangelfuld af både BLM og VRN, de fandt et markant fald i rødt replikationssignal i 14K telomerer, hvilket tyder på en vis funktionel overlapning mellem BLM og VRN med hensyn til førende strengsyntese ud for den g-rige streng af telomerer. Til støtte for denne konklusion var der mere G4-farvning af BG4-antistoffet i celler, der var dobbelt mangelfuld af både BLM og VRN end i celler, der manglede bare BLM eller bare VRN. Dette er den første direkte demonstration in vivo af et bidrag fra BLM-og VRN-helikaser i opløsningen af G4-strukturer, hvilket især er nødvendigt for progression af førende strengsyntese, der initierer i telomerer og kopieres fra den G-rige streng.