the Embryo Project Encyclopedia

fra 1958 til 1961 udviklede Leonard Hayflick og Paul Moorhead i Usaudviklet en måde i laboratoriet til at dyrke stammer af humane cellermed komplette sæt kromosomer. Tidligere kunne forskere ikkeopretholde cellekulturer med celler, der havde to komplette sæt afkromosomer som normale humane celler (diploid). Som et resultat, forskerekæmpede for at studere human cellebiologi, fordi der ikke var en pålideligkilde til celler, der repræsenterede diploide humane celler. I Dereseksperimenter, Hayflick og Moorhead skabte varige stammer af menneskeceller, der bevarede begge komplette sæt kromosomer. De frøs derefter prøver fra kulturerne, så cellerne forblev levedygtige til Fremtidsforskning. De bemærkede også, at celler kun kunne opdele en visantal gange, før de nedbrydes og døde, et fænomen senerekaldte Hayflick-grænsen. Hayflick og Moorheads eksperiment muliggjorde forskning i udviklingsbiologi og vacciner, der var afhængige af humancell-stammer. Hayflick har specialiseret sig i dyrkning af celler i kontrollerede miljøer. I 1958 sluttede han sig til Vistar Institute i Philadelphia, Pennsylvania, en forskningsinstitution, der studerede cellebiologi ogvira, på invitation af Instituttets nye direktør, Hilarykoprovski. Kopovski gav Hayflick til opgave at skabe cellekulturer tilbrug i forsøg fra andre forskere ved instituttet. Hayflicklater mindede dog om, at han brugte sin forskningsopgave som en mulighed for at studere metoder og begrænsninger af cellekulturer. For at hjælpe med at dyrke celler rekrutterede Hayflick sin kollega Paul Moorhead,som studerede strukturen og funktionen af celler ogkromosomer.

manglen på levetid hos normale humane cellekulturer ilaboratoriet begrænsede forskning, som forskere kunne gøre. Med cellkulturer vokser forskere populationer af celler i glasvarer ikontrollerede betingelser til brug i forskning. Forskere vokser typiskcellekulturer i glasvarer eller petriskåle,der indeholder vækstmedium, en opløsning indeholdende opløste salte, sukkerarter og andre cellenæringsstoffer. I løbet af første halvdel af det tyvende århundrede antog forskere,at alle normale, sunde cellekulturer havde en innovativ evne til at opdele på ubestemt tid baseret på tidligere fundingspubliceret af biolog Aleksis Carrel i 1912 i USA. I praksis observerede forskerne dog ikke endeløs opdeling i normale celler.I stedet nedbrydes cellerne i kulturen til sidst og døde. Forskereplaceret, at celler nedbrydes, fordi de havde udtømt kulturvækstmediet af alle dets næringsstoffer, eller fordi laboratorieteknikere ikke havde opretholdt ideelle miljøforhold forcellulær vækst. De eneste humane celler, der delte sig kontinuerligt ilaboratorieindstillinger, kaldet udødelige cellelinjer, var celler afledt af kræftceller. Disse cellelinjer repræsenterede kun nogle aspekter af human cellebiologi.

i midten af det tyvende århundrede, medicinskforskere kunne ikke forklare, hvad der forårsagede kræft,og mange forskere, herunder Hayflick og Moorhead, antog, at visse viruskunne forårsage kræftvækst. Selvom mange mikrobiologer anvendteceller afledt af kræftcellelinjer i medicinsk forskning, blev cellerneblev generelt ikke brugt til udvikling af vacciner, fordiforskere bekymrede sig for, at vaccinerne ville være forurenet medkræftfremkaldende vira muligvis indeholdt i cellerne selv. Desuden var celler fra kræftlinier på grund af deres konstantdivision heteroploid, hvilket betyder, at de enten havde større eller færre antal kromosomer end normale humane celler, som har to komplette sæt kromosomer. Heteroploide celler skyldes ofteDen kontinuerlige celledeling gennem mange generationer af celler ikultur. Hayflick og Moorehead producerede humane celler, der kunne blive dyrket gennem mange generationer, som celler fra kræftcellelinjer, men bevarede også cellernes diploide antal kromosomer og reducerede risikoen fra teoretiske kræftfremkaldende vira. Debeskrev deres eksperiment i” den serielle dyrkning af humane DiploidCell-stammer”, udgivet i 1961.

Hayflick og Moorhead søgte atudvikle stammer af humane celler, der kunne dyrkes i lang tidperioder i laboratoriet, men alligevel bevarede deres diploidantal kromosomer. De antog, at hvis de vartransplanteret små prøver af diploide humane celler fra allerede voksende kulturer til et nyt vækstmiljø, ville de i høj grad øgeantallet af diploide celler i kultur. Hayflick og Moorhead foreslog, at frysning af små mængder diploide celler ville sætte cellulær vækst og opdeling på pause uden at dræbe cellerne. Frosne celler kunne derefter opbevares, indtil forskere krævede dem, på hvilket tidspunkt de kunnehøne de frosne celler og genoprette dem til normal cellulær aktivitet.Hayflick og Moorhead forudsagde, at de dyrkede celler efter optøning ikke ville blive heteroploide som celler fra andre linjer og ville bevare deres diploide sæt kromosomer. Hayflick og Moorhead ‘ s eksperiment havde til formål både at skabe en metode til dyrkning af humane diploidceller i laboratoriet til langvarig forskningsbrug og at bestemmeom disse cellestammer bidrog til kræftvækst.Hayflick og Moorhead voksede først humane celler i laboratorievækstkulturer, transplanterede små prøver af celler i nye beholdere for at vokse yderligere cellekulturer og frøs prøver af celler fra disse kulturer for at bevare cellerne til senere forskning. Dernæst for at teste omde frosne celler stadig var levedygtige til forskning, Hayflick og Moorheadoptø de frosne celler og forsøgte at dyrke cellekulturer fra dem.Endelig implanterede de prøver af disse humane diploide cellestammer ilevende væv for at se, om de førte til kræftvækst. for at udvikle sigdiploide humane cellestammer begyndte Hayflick og Moorhead at dyrke celler fra 25 forskellige væv hentet fra aborterede fostre. Disse celler blev 25 forskellige humane cellestammer, navngivet numerisk med-1 Gennem med-25. Vi stod for Vistar Institute, hvor cellestrækninger blev udviklet. Hayflick og Moorhead brugte føtalvfordi mere end voksne celler, fosterceller lettere udvikletind i fibroblastceller, som er specialiserede celler, der giverstrukturel støtte til de fleste kropsvæv. Fibroblastceller varforetrukne til laboratoriecelledyrkning, fordi de voksede hurtigt og kontinuerligt i cellekulturer, hvilket gav en overflod af celler til forskning. Hayflick og Moorhead skar hver af vævsprøverne ind ismå, tynde skiver og implanterede dem derefter på den indre væg af glasflasker fyldt med næringsrige vækstmedier. Hayflick og Moorheadderefter placerede de vævsbelagte flasker af hver cellestamme i et varmt miljø i tre dage og erstattede regelmæssigt vækstmediet med en frisk forsyning for at begynde at dyrke cellekulturen.

Hayflick ogmoorhead lad kulturerne vokse, indtil cellerne belagte hele glasflasken. Hver prøve af føtalceller blev derefter opdelt ved en proceskaldet subkultivering. Under subkultivering, Hayflick og Moorheadfjernet en lille prøve af celler og implanterede disse celler på væggen i en ny glasflaske fyldt med vækstmedium, skaber en nycellekultur af samme cellestamme. Hver ny cellekulturkonstituerede en ny generation af celler, der i sig selv kunne videreuddyrkes ved den samme metode, hvilket muliggør det samlede antal cellerat vokse eksponentielt. Hayflick og Moorhead delte derefter prøver af de resterende celler i små portioner og frøs dem for at stoppe cellernes vækst og standse enhver yderligere celledeling.

Hayflick og Moorheadfortsatte subkultiverende celler to gange om ugen i ca.ti måneder, påhvilket tidspunkt cellekulturerne stoppede med at vokse og begyndte at nedbrydes.Hayflick og Moorhead antog, at cellerne var stoppet med at opdele på grund af en opbygning af giftige produkter af cellulær vækst ivækstmediet. Hayflick og Moorhead forsøgte at introducere frisk vækstmedium, der var fri for eventuelle toksiner, men cellekulturerne fortsatte med at nedbrydes og dø i løbet af de næste par måneder. Imidlertid blev andre cellekulturer placeret i samme vækstmedium ikke nedbrydetog dø. Forskerne konkluderede, at noget om cellerneselv, ikke deres miljø, fik dem til at begynde at forværres.Hayflick og Moorhead forsøgte derefter at afgøre, om de celler, de havde frosset, stadig kunne bruges til at dyrke flere cellekulturer. Efter optøning af små prøver af celler, Hayflick og Moorheadimplanterede cellerne på væggene i glasflasker. De dyrkede dem igen i vækstmedier og opdagede, at selv efterfrysning voksede cellerne stadig i nye kulturer, som selv kunne blive subkultiveret. Uanset tidligere frysning eller subkultiveringer kunne forskere bruge prøver fra diploide humane cellekulturer til at voksemere diploide humane cellekulturer. Hayflick og Moorhead havde skabt adiploid menneskelig cellestamme, der kunne dyrkes i laboratoriekulturer på ubestemt tid. Hayflick og Moorhead undersøgte derefter, omeller ikke cellerne dyrket i de nye kulturer var diploide. Da de skrev om eksperimentet, sagde de, at de var bekymrede for, at cellerne måske ikke var forblevet diploide, fordi de havde vokset dem over mange generationer, hvilket kan føre til heteroploidi. Ved hjælp af lysmikroskoper så Hayflick og Moorhead på prøver af celler under metafasen af celledeling, når kromosomer er forskellige og let set. De tællede antallet af kromosomer i 250individuelle celler for at opnå et skøn over, hvor mange celler der stadig havde adiploid antal kromosomer. Hayflick og Moorhead fastslog detmere end 97 procent af cellerne var diploide selv efter mere end tyvegenerationer af subkultivering. Hayflick og Moorhead konkluderede, at deres proces med seriel dyrkning og frysning af føtalceller var en effektiv metode til bevarelse af en diploid human cellestamme. endelig havde Hayflick og Moorhead brug for at vise, at deres cellestammer ikke gjorde detforårsage kræft. Problemet med de udødelige cellelinjer skabt frakræftceller var, at forskere antog, at cellerne måske indeholder kræftfremkaldende vira. For at sikre, at deres nye cellestammer ikke forårsagede kræft, testede Hayflick og Moorhead thevi-25 cellestamme i levende væv. De valgte vi – 25-stammen, fordi den havde gennemgået de fleste underinddelinger og var den mest sandsynlige stamme til at forårsage kræft. Derfor, hvis det ikke gjorde det, var det sandsynligtat ingen af de andre stammer heller ville.

forskerne implanteredeceller fra VI-25 cellestammen i kindposerne af fem livinghamsters. Som en eksperimentel kontrolgruppe implanterede de også femandre hamsters kindposer med celler afledt af kræftcellelinjer. I første omgang optrådte knuder, et tidligt tegn på at udvikle kræfti kontrolposerne af begge sæt hamstere. Imidlertid, efter tre uger, næsten alle knuder i hamstere implanteret med vi-25celler var forsvundet, mens knuderne i hamstere implanteret med celler fra kræftceller linjer var alle steget i størrelse. Hayflickog Moorhead udførte biopsier af de resterende knuder for at bekræftederes forudsigelse om, at deres subkultiverede celler ikke forårsagede kræft.Biopsierne viste, at knuderne i hamstere implanteret med cellerfra kræftcellelinjer faktisk var kræftformede, mens vi-25 cellenodlerne skyldtes betændelse og blødning ved implantationssiten. Hayflick og Moorhead implanterede også en lignende human celletrain, vi-1, i muskelvævet hos fem døende kræftpatienter.Han implanterede også celler fra kræftcellelinjer i fem andreterminale kræftpatienter. Ligesom i hamstere voksede i første omgangpå implantationsstederne i begge grupper. Efter et par dage, denvi-1-celleknuder begyndte at falde tilbage, mens knuderne multiplicerede indlagte patienter implanteret med celler fra kræftcellelinjer. I slutningen af en uge, næsten alle vi-1 knuder var forsvundet, og Hayflick andMoorhead biopsierede de resterende knuder i begge grupper. Resultaterne af biopsierne viste, at kræftcelleknudlerne var heteroploidceller, mens vi-1-knuderne var diploide og ikke-kræftformede. Hayflickog Moorheads resultater, som de offentliggjorde i 1961,demonstrerede, at menneskelige diploide celler kunne formeres over mange generationer, som kræftcellelinjer, uden at blive heteroploide eller cancerousselv.

resultaterne havde en øjeblikkelig og varig indvirkning påforståelsen af udviklingsbiologi og videnskabelig forskning. Resultaterne af deres eksperiment bekræftede Carrels hypotese fra 1912 om, at normale celler voksede på ubestemt tid i kultur, på trods af observationer af cellekulturer, der nedbrydes over tid. Carrel havde antydet, at årsagen til, at celler i praksis syntes at forværres, og alder overarbejde skyldtes ufuldkomne laboratorievækstbetingelser for cellerne.Carrel hævdede, at celler i kulturer under ideelle forhold kunneopdele på ubestemt tid og effektivt fungere som en udødelig cellelinie.Hayflick og Moorheads resultater viste imidlertid, at aldring af organismer sker på cellulært niveau,en proces kaldet aldring, og at celler kun kunne gennemgå et begrænset antal divisioner Førde nedbrydes og døde. Under deres eksperiment forsøgte Hayflick og Moorheadforsøgte løbende at dyrke føtalceller og erstatte gammel vækstmedium med frisk, næringsrig medium. Men de fandt detefter omkring fyrre eller tres generationer begyndte cellerne at dø snarereend reproducere, et fænomen senere kaldet Hayflick-grænsen. DetResultatet viste, at cellerne ikke kunne vokse på ubestemt tid ikultur, selv under ideelle forhold. Hayflick og Moorheads metode til seriel dyrkning af humane diploide celler hjalp også forskere med at opretholde en rigelig forsyning af diploide humane celler til forskning. Ved Hayflick og Moorheads beregninger kunne en enkelt menneskelig cellestamme subkultiveres nok gange til at producere næsten 20 tons levedygtige celler. Selvom det ikke er teknisk udødeligt, ville denne forsyning være tæt på uudtømmelig til praktiske forskningsformål.

desuden muliggjorde oprettelsen af levedygtige diploide humane celler vaccineforskning.Fordi Hayflick og Moorhead viste, at deres humane cellestammer ikke forårsagede kræft hos hamstere eller mennesker, kunne disse stammer anvendes invacciner uden trussel om at forurene vaccinen med noget kræftfremkaldende middel. Efterfølgende lignende afledte humane cellestammer, såsom vi-38, blev grundlaget for vacciner mod børnesygdommesom røde hunde og skoldkopper.

mens mange forskere hilste udviklingen af humane cellestammer af Hayflick og Moorhead, afviste nogle,herunder Den Katolske Kirke, brugen af aborteret frugtmateriale i udviklingen af vacciner af religiøse grunde. Vatikan erklærede senere, at de protesterede mod metoden til udvikling af vacciner afledt af føtalvæv, ikke mod individets anvendelse af disse vacciner til forebyggelse af sygdomme.

Hayflick og Moorhead demonstreredeikke kun,at humane celler med succes kunne dyrkes ilaboratoriet, mens de stadig opretholdt et diploid antal kromosomer, men også at de kunne opretholde cellerne næsten ubestemt gennem seriel subkultivering. Desuden lagde deres eksperiment grunden til Hayflick for yderligere at undersøge grænsen for celledeling i kultur, senere kaldet Hayflick-grænsen. Hayflick og Moorhead ‘ sopdagelser muliggjorde yderligere eksperimenter i udviklingsbiologi og vaccineudvikling ved at tilvejebringe rigelige humane celler til forskning.