El cloruro de litio mata eficazmente al parásito Varroa destructor de las abejas melíferas mediante un modo de acción sistémico
Estudio piloto: De ARNI a cloruro de litio
En un estudio piloto, las abejas melíferas infestadas de ácaros fueron enjauladas y alimentadas con jarabe de sacarosa que contenía ARNS de genes Varroa potencialmente esenciales (Tabla suplementaria S1). El jarabe de sacarosa simple (sin tratar) y el jarabe con dsRNA basado en la secuencia de codificación de la proteína verde fluorescente GFP (dsGFP ctrl) sirvieron como controles. La GFP se expresa en la medusa hidrozoana bioluminiscente Aequorea victoria. La secuencia GFP se eligió como control porque no existe ningún gen homólogo en el genoma de las abejas melíferas o del ácaro Varroa. En el grupo no tratado, la mortalidad por ácaros fue < 5%. Por el contrario, todos los ácaros de las abejas que recibieron solución de sacarosa que contenía dsRNA dirigido a genes Varroa se mataron efectivamente en tres días. Sin embargo, se observó un efecto idéntico en los ácaros en un experimento de control en el que se alimentó a abejas con GFP dsRNA (Suplemento Fig. S1). Estos resultados descartaron el mecanismo propuesto mediado por ARNi, pero sugirieron un efecto aún desconocido del ARN o la actividad de otros componentes en la solución de prueba. Como se utilizaron altas concentraciones de cloruro de litio (LiCl) en la producción de dsRNAs y, por lo tanto, se alimentaron a las abejas junto con el dsRNA, optamos por alimentar LiCl en solución de sacarosa a las abejas enjauladas para probar su actividad contra los ácaros Varroa. Sorprendentemente, LiCl en concentraciones de 25 mm, que corresponde a la concentración calculada en la solución de dsRNA, mató a los ácaros con la misma eficacia que las sustancias de ensayo que contenían dsRNA. Además, después de que el LiCl se eliminó en gran medida del dsRNA mediante un lavado extensivo (ctrl dsGFP lavado), la actividad miticida disminuyó sustancialmente, como lo indica el inicio retardado y la actividad reducida (Fig.Suplementaria. S1). A partir de estos datos, concluimos que el LiCl, no la caída del ARN, mediaba la actividad observada en los ácaros Varroa y que valdría la pena analizar el potencial del LiCl como varroácido.
Concentración efectiva de cloruro de litio
Para corroborar las observaciones primarias de nuestro estudio piloto, establecimos experimentos en jaula con diferentes concentraciones de LiCl para un análisis estadístico sólido. Además de la concentración de 25 mm, que resultó eficaz en el estudio piloto, se utilizaron concentraciones de 2 mm, 4 mM y 10 mM para determinar el umbral de eficacia más bajo. Los resultados respaldaron los hallazgos del estudio anterior y demostraron efectos miticidas significativos para concentraciones de LiCl de hasta 2 mm, con lo que se mostró un aumento sustancial de la mortalidad por ácaros (P < 0,001, prueba de rango logarítmico; Tabla complementaria S2). Las concentraciones más altas de 10 mm y 25 mM mejoraron significativamente la mortalidad de los ácaros a partir del segundo día de tratamiento y lograron la exterminación de más del 96% de los ácaros tratados al final del experimento (Fig. 1a, Cuadro Suplementario S2). En los experimentos de control sin LIC en la solución de alimentación, la mortalidad de los ácaros alcanzó un promedio del 9,3% y, por lo tanto, se situó dentro del rango de las tasas de mortalidad obtenidas para los ácaros mantenidos en abejas de jaula no tratadas en diferentes condiciones ambientales33. Con base en estos resultados, confirmamos un efecto claro de LiCl en la viabilidad de ácaros en un rango de concentración entre 2 mm y 25 mm.
En estos experimentos, las abejas enjauladas fueron alimentadas con la concentración respectiva de LiCl durante varios días hasta que todos los ácaros fueron matados por el tratamiento. Sin embargo, para su posible uso en la práctica de la apicultura, sería preferible un período de tratamiento más corto y definido. Por lo tanto, realizamos un experimento adicional, en el que la concentración más efectiva de 25 mm LiCl (Fig. 1a) se administró durante 24 h seguido de alimentación con solución de azúcar durante seis días adicionales. Al final del período de observación, 92.el 9% de los ácaros (n = 225 ácaros, P < 0,001, prueba de rango logarítmico) fueron sacrificados sin ningún efecto significativo en las abejas tratadas (véase el párrafo siguiente). Este resultado demuestra claramente que incluso una alimentación a corto plazo de 25 mm de lóbulo es suficiente para disminuir sustancialmente la población de ácaros.
Para determinar con precisión la cantidad de LiCl ingerida por las abejas que es necesaria para matar ácaros parásitos, 12 abejas recién nacidas fueron alimentadas artificialmente con 10 µl de soluciones LiCl de 4 mm a 100 mm y mantenidas individualmente con un ácaro forético durante cinco días en jaulas. Con las soluciones de 4 mm y 10 mM, que correspondieron a una absorción de 1,7 µg y 4,2 µg de LiCl, respectivamente, el efecto no fue significativamente diferente del control no tratado (n = 12 ácaros, P = 1.000, prueba de rango logarítmico, Tabla suplementaria S3). Sin embargo, una sola dosis de 25 mm, correspondiente a 10,6 µg de LiCl consumida por la abeja, fue suficiente para matar el 100% de los ácaros foréticos en 48 horas (Fig. 2).
Mortalidad de ácaros Varroa foréticos mantenidos en abejas alimentadas individualmente con 10 µl de una solución de cloruro de litio en concentraciones que van de 4 mm a 100 mm. Las abejas fueron alimentadas con LiCl solo una vez al comienzo del experimento, luego recibieron jarabe de sacarosa durante cinco días. Para cada concentración, se analizaron 12 jaulas con una abeja y un ácaro varroa cada una. La supervivencia de los ácaros se redujo significativamente en comparación con el grupo de control cuando se alimentaron a las abejas concentraciones de 25 mm y superiores(P < 0,001, prueba de rango logarítmico).
Efecto en las abejas obreras
Para el análisis de la tolerabilidad de LiCl a las abejas obreras, las jaulas de prueba que se utilizaron para analizar la mortalidad de ácaros (Fig. 1a) se registraron adicionalmente para la mortalidad de las abejas obreras. Tras la exposición a LIC de 2 mm, 10 mM y 25 mM que han demostrado ejercer actividad miticida, la mortalidad de las abejas obreras tratadas osciló en promedio entre el 3 y el 7% dentro de los diferentes grupos de alimentación. Con la excepción del grupo de LIC de 10 mm (n = 12 jaulas, P = 0,015, prueba de rango logarítmico; Tabla suplementaria S4), los valores no fueron significativamente diferentes de la mortalidad del 4% en el grupo control no tratado. Además, las tasas de mortalidad de nuestros controles estaban muy dentro del rango de la mortalidad de las abejas de jaula no tratadas requerida como control en las pruebas toxicológicas34, lo que confirma la validez de nuestro sistema de pruebas. Además, el tratamiento de 24 h con LIC no afectó a la mortalidad de las abejas obreras (Fig. 1b; n = 9 jaulas, P = 0,308, prueba de rango logarítmico). También se confirmó una buena tolerabilidad de LIC a las abejas mediante la alimentación de una sola dosis (para la mortalidad de ácaros, véase la Fig. 2) que no provocaron un aumento significativo en la mortalidad de las abejas obreras (P = 1.000, prueba de rango logarítmico; Tabla Suplementaria S5).
A continuación, se alimentaron continuamente diferentes concentraciones de LiCl hasta que murió la última abeja enjaulada para investigar la respuesta a la exposición a largo plazo. En este caso, el tratamiento redujo significativamente la vida media de las abejas obreras recién nacidas de 26 días en las jaulas de control no tratadas a 23 y 22 días para LIC de 2 mm y 10 mM, respectivamente (n = 60 abejas, P = 0,024, prueba de rango logarítmico; Tabla suplementaria S6). En las abejas que recibieron la mayor concentración de 25 mm LiCl, la vida útil se redujo significativamente a 19 días en promedio (Fig. 3a).
Mortalidad de abejas melíferas después de alimentar a abejas enjauladas con cloruro de litio. a) Curva de supervivencia de Kaplan-Meier de abejas obreras enjauladas durante la exposición crónica a LIC. Se alimentaron dietas LiCl a concentraciones de 2 mm, 10 mM y 25 mm ad libitum hasta la muerte de la última abeja (n = 6 jaulas con 10 abejas cada una). La supervivencia de todos los grupos tratados fue significativamente diferente de la del control del jarabe de azúcar (P < 0,01, prueba de rango logarítmico con corrección de Bonferroni). b) Curva de supervivencia de Kaplan-Meier de abejas obreras enjauladas tras una exposición de 24 horas a LIC. Las dietas LiCl a concentraciones de 2 mm, 10 mM y 25 mM se alimentaron ad libitum durante las primeras 24 h después de la eclosión y luego se reemplazaron por jarabe de sacarosa (n = 12 jaulas con 10 abejas cada una). La supervivencia de todos los grupos tratados no fue significativamente diferente de la del control del jarabe de azúcar (P > 0,1, prueba de rango logarítmico con corrección de Bonferroni).
Sin embargo, el LiCl parece impedir la viabilidad de las abejas solo si se administra durante un período prolongado de tiempo, como indica un experimento adicional en el que se alimentó el LiCl durante las primeras 24 horas después de la eclosión y luego se reemplazó por jarabe de sacarosa hasta que murió la última abeja enjaulada (Fig. 3b). En este caso, la esperanza de vida media de las abejas obreras recién nacidas osciló entre 22 días (10 mm) y 24 días (control) sin diferencias significativas entre los tratamientos (n = 120 abejas por tratamiento, P ≥ 0,126, prueba de rango logarítmico; Tabla suplementaria S7). Con base en estos datos de abejas enjauladas, concluimos que incluso un tratamiento de LIC a corto plazo es suficiente para erradicar por completo la infestación de ácaros Varroa con poco o ningún impacto en la viabilidad de las abejas obreras. Estos resultados obtenidos en pruebas en jaula en condiciones controladas representan un primer paso exitoso y prometedor hacia un nuevo enfoque para el tratamiento de Varroa. Sin embargo, la eficiencia y los efectos secundarios deben confirmarse en condiciones de campo.
Pruebas de campo con cloruro de litio en enjambres artificiales
Para aproximar las condiciones de campo, probamos LIC de 25 mm y 50 mm en nueve enjambres artificiales sin cría que constaban de una reina y aproximadamente 20.000 abejas cada uno. Estas concentraciones se eligieron en base a experimentos anteriores con abejas enjauladas utilizando la dosis más alta que las abejas seguían tolerando en tiempos de aplicación cortos (25 mm). Debido a que una distribución uniforme de jarabe de sacarosa en todo el enjambre artificial de aproximadamente 20,000 abejas podría haber sido difícil de lograr, además, probamos una concentración de 50 mm de LiCl para garantizar que cada abeja estuviera expuesta a cantidades suficientes de litio. En consecuencia, los enjambres se alimentaron ad libitum con jarabe de sacarosa que contenía 25 mm LiCl (n = 6) o 50 mM (n = 3) durante un período de tres días, seguido de una aplicación tópica de Perizin®. Perizin®, que contiene el cumafós organofosforado como ingrediente activo, es un varroácido altamente eficaz que se usa comúnmente como tratamiento de control35. La mortalidad por ácaros se monitorizó durante un período de cinco días. Antes del tratamiento de control, el LIC de 25 mM mató aproximadamente el 90% de los ácaros presentes en los enjambres artificiales (Tabla 1). Sin embargo, la solución concentrada más alta (50 mm) no aumentó este efecto (prueba de χ2, P = 0,953). En conjunto, la eficacia fue algo menor en comparación con las pruebas en jaula. Una explicación podría ser que la distribución de LiCl dentro de un grupo de miles de abejas requiere más tiempo hasta que la última abeja individual consuma una dosis suficiente para matar al ácaro parásito respectivo. El tiempo de alimentación necesario de entidades tan grandes de 20.000 abejas y más debe analizarse en otros experimentos.
Eficacia de otros compuestos de litio y sales sin litio
Para confirmar que el litio es el componente activo del efecto sobre los ácaros Varroa, probamos una serie de compuestos de litio y comparamos los efectos miticidas con sales sin litio. De particular interés fue el citrato de litio, un compuesto con tres iones de litio, sulfato de litio y carbonato de litio, que tienen dos iones de litio en comparación con un solo ion de litio en LiCl. Se incluyeron compuestos adicionales con un ion de litio (lactato de litio, acetato de litio), pero con diferente solubilidad, reactividad química y precio para analizar la eficacia y tolerabilidad en comparación con LiCl. En experimentos en jaula, todos los compuestos eliminaron el 100% de los ácaros a 25 mm en un plazo de tres (citrato de litio y acetato de litio) a cuatro días (sulfato de litio, lactato de litio y carbonato de litio). Además, las soluciones de prueba de 4 mm eliminaron completamente los ácaros foréticos en un plazo de cinco (citrato de litio, sulfato de litio y acetato de litio) a siete días (lactato de litio), excepto el carbonato de litio (Tabla 2; Tabla suplementaria S8).
La mortalidad de las abejas obreras no aumentó significativamente en ninguna de las concentraciones en comparación con las abejas control no tratadas, excepto para sulfato de litio de 25 mm y lactato de litio de 25 mM (Tabla suplementaria S9). Con estos experimentos pudimos confirmar que otros compuestos de litio tienen un potencial similar para el uso como acaricida sistémico. Esto podría aumentar la flexibilidad para el posible diseño de un producto veterinario. Teniendo en cuenta el precio, el cloruro de litio y el citrato de litio son los compuestos más baratos. El sulfato de litio es menos adecuado debido a la menor tolerabilidad de las abejas y el carbonato de litio debido a una solubilidad en agua relativamente baja.
Para investigar la eficacia dependiente de la concentración de compuestos de litio con más detalle, comparamos LiCl con citrato de litio (Li3C6H5O7), que tenía la mayor diferencia en el número de iones de litio por molécula, a cinco concentraciones diferentes en un rango de 1 mm a 25 mm. Todas las concentraciones de citrato de litio mostraron una actividad acaricida significativamente mayor en comparación con LiCl, pero no hubo diferencia en la mortalidad de las abejas (Tabla 3, Tablas Suplementarias S9 y S11). Por lo tanto, el citrato de litio podría representar un ingrediente activo aún mejor.
Como control libre de litio y para descartar el cloruro como agente activo, también probamos las sales alcalinas cloruro de sodio (NaCl) y cloruro de potasio (KCl) y también cloruro de magnesio (MgCl) a 25 mm. No observamos un efecto varroacidal para NaCl o KCl (n = 3 jaulas, P = 1.000, prueba de rango logarítmico, Tabla Suplementaria S12). En las pruebas con MgCl, el 100% de las abejas enjauladas murieron en un plazo de cinco días (P < 0.001, prueba de rango logarítmico), y de acuerdo con el número decreciente de abejas, el experimento se terminó antes de que se pudiera analizar el efecto sobre los ácaros. Sobre la base de estos experimentos, concluimos que el litio de hecho media la actividad acaricida de una manera dependiente de la dosis y que el citrato de litio exhibe las propiedades más favorables de todos los compuestos probados hasta ahora.
Potencial de los compuestos de litio como nuevo varroácido
Hemos demostrado que no los ARN de doble cadena hipotéticos inicialmente contra genes Varroa esenciales, sino las sales de litio, sorprendentemente, median un fuerte efecto acaricida sobre los ácaros Varroa en abejas enjauladas y en enjambres artificiales. Por lo tanto, estos resultados muestran que los compuestos de litio representan una nueva clase de agentes acaricidas con un potencial excepcional y una tolerabilidad notablemente buena para las abejas. La diferente susceptibilidad de ácaros y abejas al LiCl es aún más notable teniendo en cuenta que, debido a los efectos de dilución, la concentración de LiCl en la hemolinfa de las abejas probablemente será sustancialmente menor que la concentración alimentada a las abejas.
Es importante destacar que nuestros hallazgos no implican que los efectos acaricidas de los abordajes basados en ARNi, según lo publicado por Garbian et al.32 son generalmente mediadas por LiCl. Después de alimentar a las abejas melíferas con una mezcla de dsRNA durante un período de 60 días, Garbian et al.32 registraron un aumento lento de la mortalidad por ácaros con una eficacia del tratamiento final de solo el 60%. En vista de la respuesta rápida y altamente efectiva de nuestros enjambres artificiales a los tratamientos con LiCl, es probable que haya diferentes modos de acción: mientras que los efectos mediados por ARNi parecen ejercer efectos a largo plazo, los compuestos de litio representan un mecanismo independiente con inicio rápido y alta eficacia.
Como varroacida, LiCl muestra algunas características que son únicas en esta combinación: i) el LiCl actúa sistémicamente mediante la alimentación de abejas melíferas («fácil de aplicar»), ii) es soluble en agua y,por lo tanto, no se acumulará en la cera de abejas, lo que constituye un problema crucial para los conceptos de tratamiento a largo plazo que utilizan varroácidos sintéticos con propiedades lipofílicas36, 37, iii) la toxicidad oral de la mayoría de los compuestos de litio para los mamíferos es relativamente baja38, iv) no tiene efecto repelente sobre la solución de alimentación dentro del intervalo de concentración pertinente de 2 a 25 mm39, y v) está disponible a precios moderados. Muy prometedor es el hecho de que una sola aplicación de solo 10 µl de LiCl en una solución de 25 mm (correspondiente a una dosis de 10,6 µg de LiCl) por abeja individual es suficiente para matar ácaros foréticos. Un desafío para futuras investigaciones será el desarrollo de una técnica de aplicación inteligente para enjambres y colonias de tamaño completo para garantizar que todas las abejas reciban la cantidad crítica del compuesto activo.
Actualmente, no sabemos cómo el LiCl está matando a los ácaros Varroa foréticos, y hay pocas publicaciones sobre el efecto del LiCl en los insectos40. En medicina humana, el litio se ha utilizado desde la década de 1870 y es un agente estabilizador del estado de ánimo indicado para el tratamiento de episodios maníacos y como tratamiento de mantenimiento para el trastorno bipolar 41. En vista de su uso terapéutico, se han investigado cuidadosamente los compuestos de litio y su perfil de toxicidad. Hasta ahora, se han propuesto como objetivos potenciales una serie de enzimas que actúan sobre el metabolismo, el desarrollo,la hematopoyesis y otros procesos42, 43. Estas enzimas requieren iones metálicos y el litio ejerce su actividad de manera no competitiva, lo que muy probablemente ocurre al desplazar un catión divalente. Es cierto que actualmente no tenemos indicios de que el efecto miticida observado de los compuestos de litio dependa de un modo de acción comparable.
También somos conscientes de que nuestros resultados representan solo el primer paso hacia el desarrollo de un nuevo producto veterinario. Las pruebas de campo en colonias de vuelo libre son tan necesarias como el análisis de los efectos secundarios subletales y a largo plazo en abejas adultas y cría de abejas melíferas y los posibles problemas de residuos en la miel.
Sin embargo, los resultados presentados aquí ya indican que el LiCl tiene potencial como tratamiento eficaz y fácil de aplicar para enjambres artificiales y naturales y,en particular, para el gran número de abejas envasadas utilizadas para la polinización en los Estados Unidos11, 44. Además, el esclarecimiento del mecanismo de acción podría abrir nuevas vías para el desarrollo específico de productos veterinarios para combatir los ácaros varroa.