Monitoreo temprano del tratamiento de la tuberculosis por Xpert ® MTB / RIF

Para los editores:

El progreso realizado para mejorar la capacidad de laboratorio para el diagnóstico de la tuberculosis (TB) condujo al desarrollo de ensayos moleculares que ahora están reemplazando a la microscopía convencional y los métodos basados en cultivos a gran escala . Desafortunadamente, las técnicas moleculares actuales detectan bacterias vivas y muertas, y un resultado positivo no implica la viabilidad del patógeno. De hecho, el ADN puede persistir durante un largo período después de la muerte bacteriana y el ácido nucleico de bacterias muertas es igualmente amplificable. Por lo tanto, los ensayos moleculares no son adecuados para la monitorización del tratamiento y/o para el control de infecciones.

Presentamos un enfoque innovador para amplificar selectivamente el ADN derivado de Mycobacterium tuberculosis viable en muestras clínicas, que es útil para monitorear la carga micobacteriana en pacientes con tuberculosis pulmonar durante el tratamiento antituberculoso.

El protocolo se basa en el pretratamiento de muestras con monoazida de propidio (PMA; Biotium Inc., Hayward, CA, EE.UU.), un compuesto químico que puede intercalar el ADN de organismos no viables (o dañados por la membrana), pero está excluido de bacterias viables. Después de la activación de la luz, la PMA se une covalentemente al ADN, evitando su amplificación por PCR . Después de la exposición a la luz, la PMA no unida no puede interactuar más con las moléculas de ADN.

El ensayo se optimizó primero utilizando muestras de esputo negativas de bacilos ácido-rápidos (AFB) enriquecidas con micobacterias vivas o muertas a diferentes concentraciones. En resumen, se agregaron células vivas de Mycobacterium fortuitum a muestras de esputo descontaminadas de N-acetil-cisteína negativas para AFB por microscopía de frotis a una concentración final de 106 bacterias * mL-1. Una alícuota de esta muestra hecha en laboratorio fue tratada para matar térmicamente las células de M. fortuitum. La solución madre PMA se preparó y almacenó a -20°C y se protegió de la exposición a la luz, hasta su uso, según lo recomendado por los fabricantes. Se añadió PMA como pretratamiento a una concentración final de 500 µM y se incubó durante 30 min a 4°C en la oscuridad, seguido de exposición a la luz activa de diodo emisor de luz azul (LED) (GenIUL, Terrassa, España) durante 15 min a temperatura ambiente. Luego se extrajo ADN utilizando un procedimiento estándar de cloroformo fenólico. Como control para evaluar la eficacia del paso de exposición a la luz, se trató una alícuota de ADN desnudo extraído de un cultivo de M. fortuitum con 500 µM PMA previamente expuestos a la luz LED durante 15 min. A continuación, se realizó el ensayo de sonda de línea comercial (GenoType® Mycobacterium CM; Hain Lifescience, Nehren, Alemania) para identificar especies de micobacterias clínicamente relevantes . Muestras que contienen M vivo. fortuitum mostró un perfil de hibridación normal en una tira de nitrocelulosa, mientras que las muestras tratadas para matar bacterias no mostraron ninguna amplificación, excepto para el control interno (no se muestran los datos). Dado que el ADN desnudo tratado con PMA inactivado por la luz mostró un perfil de hibridación normal, el paso de exposición a la luz fue eficiente y la PCR no se inhibió aún más por la PMA residual.

Habiendo optimizado el protocolo para la inactivación del ADN derivado de bacterias muertas, lo adaptamos al ensayo automatizado Xpert® MTB/RIF (Cepheid, Sunnyvale, CA, EE.UU.). La PCR en tiempo real realizada por el Xpert ® MTB / RIF proporciona ciclos de umbral (Tc) que se pueden utilizar para calcular la diferencia en el rendimiento de amplificación entre muestras con y sin pretratamiento de PMA (ΔCt): un ΔCt bajo indica la presencia de ADN amplificable de bacterias vivas, mientras que un ΔCt alto indica que el ADN objetivo en la muestra se originó a partir de bacterias muertas o dañadas y, por lo tanto, el pretratamiento de PMA afecta significativamente su amplificación. Para calcular el valor ΔCt, se consideró la media entre los valores de Tc proporcionados para cada sonda incluida en la prueba Xpert® MTB/RIF (A a E) .

Probamos el protocolo PMA utilizando el ensayo Xpert® MTB/RIF en una curva de calibración de Tc de muestras clínicas negativas para AFB con micobacterias muertas por calor / vivas agregadas en diferentes proporciones. Las altas relaciones muertos-vivos dieron lugar a una diferencia máxima en los valores de ΔCt entre las porciones tratadas térmicamente y las porciones vivas con PMA, mientras que las muestras que contenían un porcentaje similar de bacterias muertas y vivas no pudieron diferenciarse entre sí mediante el uso de pretratamiento de PMA (no se muestran datos). Datos similares han sido reportados por Kralik et al. .

Finalmente, probamos el enfoque en muestras clínicas. en el primer estudio de validación se incluyeron 10 pacientes diagnosticados de TB pulmonar activa (frotis de esputo positivo y cultivo positivo). Se recolectaron muestras en el momento del diagnóstico (t0) y después de 10-20 días de terapia (t1), se descontaminó la N-acetil-cisteína y se procesó para el cultivo líquido MGIT-960 (BD Diagnostic Systems, Sparks, MD, EE .UU.) de acuerdo con las directrices internacionales. Todos los pacientes seguían siendo AFB positivos por microscopía de frotis de esputo en t1. En paralelo, se procesaron 250 µL de muestras descontaminadas para el análisis molecular mediante el ensayo Xpert ® MTB / RIF con y sin pretratamiento PMA. Las muestras se procesaron según lo recomendado por las instrucciones del fabricante para el ensayo Xpert ® MTB/RIF.

Como se muestra en la figura 1, la PMA no afectó significativamente el rendimiento de PCR de las muestras recolectadas en t0 (media±mem ΔCt 2,3±0,5), mientras que las muestras recolectadas durante el tratamiento en t1 mostraron una ΔCt de 10,5±0,9 después del tratamiento con PMA (p=0,0003), lo que confirma que la positividad del frotis de esputo de estas muestras se debió principalmente a bacterias altamente dañadas. Además, se encontró que el ΔCt calculado entre t0 y t1 en muestras no tratadas con PMA era demasiado bajo (ΔCt 2,9±0,9) para apreciar una disminución real de la carga bacteriana debido a la terapia.

Dos pacientes clasificados como «bajos» en t0 por el Xpert ® mostraron un cultivo negativo en t1, mientras que todos los demás pacientes clasificados como » medios «o» altos » permanecieron en cultivo positivo por MGIT. Aunque no se puede evaluar el tiempo exacto hasta la positividad, observamos que los cultivos de muestras recolectadas en t1 dieron positivo aproximadamente 7-10 días después en comparación con los cultivos de muestras recolectadas en t0, lo que sugiere una reducción severa en la carga bacteriana viva.

Todos los pacientes fueron tratados y curados con éxito al final de la terapia, y esto fue consistente con la reducción de bacterias vivas detectadas por el ensayo PMA.

Como control negativo, también incluimos retrospectivamente un caso de fracaso del tratamiento (AFB positivo y cultivo positivo después de 5 meses de tratamiento estándar). En este caso, el pretratamiento de PMA de ambas muestras de esputo descontaminadas recogidas a 1 mes y dos durante el tratamiento no afectó significativamente el rendimiento de PCR (ΔCt 2 2), lo que respaldó la ineficacia del tratamiento antituberculoso.

El mismo protocolo debe, en principio, ser compatible con otras pruebas moleculares aprobadas por la CE y ensayos de sonda de línea respaldados por la Organización Mundial de la Salud para el diagnóstico de TB; se necesitan más estudios para descartar esta posibilidad.

Estudios previos han demostrado la posibilidad de usar PMA para distinguir entre micobacterias vivas y muertas utilizando una concentración de 25-50 µM. Durante la configuración del protocolo, una concentración final de 100 µM evitó completamente la amplificación del ADN derivado de M. fortuitum muerto por calor; se observó un fondo débil debido a la amplificación del ADN de M. tuberculosis muerto por calor (no se muestran los datos). Podemos especular que la diferente composición de la pared celular afecta de alguna manera la capacidad de la PMA para penetrar micobacterias dañadas. De hecho, Kralik et al. se observó que la reducción de la señal inducida por PMA entre Mycobacterium avium subsp vivo y muerto. la paratuberculosis fue menor en comparación con las encontradas para otras especies bacterianas. Además, teniendo en cuenta la cantidad de desechos que podrían secuestrar moléculas de PMA en esputa descontaminada, aumentamos la concentración final a 500 µM. Otros estudios que evalúan las diferencias del efecto del tratamiento PMA en cepas que muestran una composición de pared celular diferente (por ejemplo, cepas de Beijing) y/o en esputas con características diferentes (por ejemplo, cepas de Beijing). esputo que contiene sangre) podría dilucidar mejor la utilidad de esta prueba en diferentes entornos clínicos.

Según LØvdal et al. , una pequeña proporción de células que se presume que están muertas o gravemente heridas no pueden crecer. La presencia de un pequeño número de células gravemente heridas pero no cultivables podría explicar por qué todavía tenemos una señal positiva en las muestras recogidas en t1 a pesar del pretratamiento de PMA. El pretratamiento de PMA no evita la detección de una pequeña proporción de células muertas (falso positivo para un ensayo de viabilidad): por lo tanto, la prueba podría sobreestimar micobacterias viables. Sin embargo, desde una perspectiva clínica, esto representaría un error menor en comparación con el riesgo (muy pequeño para esta prueba) de subestimar las micobacterias viables.

Nuestros datos indican, por primera vez, que las técnicas moleculares cuantitativas combinadas con el método PMA podrían ser una alternativa a la microscopía y el cultivo directos para monitorear la respuesta temprana al tratamiento y para la evaluación preliminar de regímenes personalizados. El uso de este ensayo puede permitir una evaluación más temprana de la eficacia del tratamiento, mostrando una clara disminución de la carga vital de micobacterias. Sin embargo, la ausencia de respuesta a la terapia también puede identificarse rápidamente mediante la prueba, lo que permite un cambio de régimen y limita la propagación de la infección y el desarrollo de resistencia adicional .

• 2 ERS 2012