PMC

Las roturas de doble hebra en el ADN pueden causar estragos en las células si no se reparan. Por lo tanto, se propuso que los extremos de los cromosomas podrían ser estructuras de capuchón especializadas que no se reconocen como roturas de doble hebra, evitando así la detención del ciclo celular, la degradación y la fusión recombinacional (Muller, 1938; McClintock, 1939). Ahora sabemos que los telómeros comprenden los extremos de los cromosomas y son esenciales para la estabilidad del genoma. Los telómeros se componen de repeticiones en tándem de cabeza a cola de una secuencia corta rica en G; por ejemplo, los telómeros humanos son 2-20 kb de repeticiones n (TTAGGG). Los extremos de los cromosomas no son romos, y el extremo 3′ (hebra rica en G) sobresale en una sola hebra que puede invadir el interior del telómero para desplazar la secuencia interna rica en G y formar una estructura de bucle en T (Griffith et al., 1999; Cesare et al., 2003; Doksani et al., 2013), protegiendo así los extremos cromosómicos de ser reconocidos por la célula como roturas de doble hebra, además de la protección por proteínas que se unen al telómero.

Los cromosomas eucarióticos se duplican a través de una replicación semiconservadora con una cadena de alargamiento (síntesis continua para el crecimiento neto en el extremo 3′ de la cadena principal naciente) y una cadena de alargamiento (síntesis discontinua de fragmentos de Okazaki para el crecimiento neto en el extremo 5′ de la cadena rezagada naciente) como se muestra en la Fig. 1. En la replicación semiconservadora cromosómica, el primer corto de ARN de 5′ se elimina de la cadena naciente y el espacio se rellena con ADN que se liga al ADN naciente adyacente. Sin embargo, al final del cromosoma, el espacio después de la eliminación de la imprimación de ARN terminal de 5′ en la hebra rezagada no se puede rellenar, y el cromosoma puede acortarse con cada ronda de replicación subsiguiente. Esto se ha denominado el problema de la replicación final (Watson, 1972; Olovnikov, 1973), y la telomerasa ayuda a resolver este problema (Greider y Blackburn, 1987; Soudet et al., 2014).

La replicación semiconservadora ocurre antes de la acción de la telomerasa. Anteriormente se pensaba que la replicación del ADN comenzaba en un origen en el ADN cromosómico adyacente a las repeticiones de telómeros, con las bifurcaciones de replicación moviéndose bidireccionalmente lejos del origen subtelomérico (Fig. 1 A), replicando así el telómero. Sin embargo, la pregunta seguía siendo si la replicación del ADN podría iniciarse con cierta frecuencia dentro del propio telómero (Fig. 1 B). Esta pregunta ya ha sido contestada en forma afirmativa en esta edición por Drosopoulos et al., who used single molecule analysis of replicated DNA (SMARD; Norio and Schildkraut, 2001). En este enfoque, las células replicantes son etiquetadas secuencialmente por dos análogos de nucleótidos diferentes que se identifican posteriormente por inmunofluorescencia. Por ejemplo, en la replicación bidireccional, las señales rojas del primer pulso estarán flanqueadas en cada extremo por señales verdes del segundo pulso. Informes anteriores que usaban SMARD habían concluido que la mayoría de las replicaciones se iniciaban en regiones subteloméricas en el genoma de ratones y humanos y rara vez en los telómeros mismos (Sfeir et al., 2009; Drosopoulos et al., 2012). En el reciente estudio de Drosopoulos et al. (2015), la hibridación fluorescente in situ (FISH) utilizando sondas de la región de los telómeros permitió analizar el patrón de replicación para un segmento genómico de 320 kb desde el extremo del brazo cromosómico de ratón 14q. Debido al largo tiempo (4 h) para el primer pulso (rojo), generalmente solo se observaron tractos rojos de señal dentro del telómero, pero dado que muchas de estas moléculas no tenían la señal roja extendida a la región subtelomérica, se puede concluir cómodamente que la replicación debe haberse iniciado dentro del telómero (Fig. 1 B). Además, algunas moléculas tenían señal roja en el telómero flanqueada por señal verde, apoyando esta conclusión. Aunque en estos casos hubo señal verde cromosómico proximal, rara vez se observó señal verde cromosómico distal. Por lo tanto, aunque hubo evidencia limitada de replicación bidireccional originada en el telómero, está muy claro que un origen de replicación puede existir dentro del telómero propiamente dicho con una bifurcación de replicación que se extiende con el tiempo hacia el subtelómero. Queda por investigar si la replicación se inicia a una frecuencia relativamente alta en los telómeros de cromosomas distintos de 14q.

Estos hallazgos plantean la cuestión de si el origen de la replicación del ADN coincide con la repetición de secuencia simple encontrada en los telómeros o, en su lugar, si coincide con alguna otra secuencia que podría intercalarse dentro del telómero. El primero es sugerido por un estudio con extractos libres de células de Xenopus que podrían ensamblar el complejo de pre-replicación y experimentar alguna replicación de ADN en ADN exógeno que contiene repeticiones exclusivamente teloméricas (Kurth y Gautier, 2010). Se han llegado a conclusiones similares de que la replicación del ADN puede iniciarse en las repeticiones simples de ADN encontradas en centrómeros donde se han observado burbujas de replicación en Drosophila virilis por microscopía electrónica (Zakian, 1976), y un estudio reciente sugiere que la replicación del ADN se inicia dentro del ADN alfa-satélite humano (Erliandri et al., 2014).

Las bifurcaciones de replicaciones se mueven lentamente a través del ADN telomérico (Ivessa et al., 2002; Makovets et al., 2004; Miller et al., 2006; Sfeir et al., 2009) debido a la alta estabilidad térmica del ADN telomérico rico en CG, así como su propensión a formar estructuras secundarias estables, como el ADN G-cuádruplex (G4), que puede plantear problemas para la replicación del ADN (Lopes et al., 2011; Paeschke et al., 2011). Varias helicasas ayudan a resolver este problema; por ejemplo, la helicasa Pif1 ayuda a desenrollar la G4(Paeschke et al., 2013). El síndrome de Bloom helicasa (BLM) y el síndrome de Werner helicasa (WRN) también han sido implicados en ayudar a la replicación de los telómeros: el BLM suprime los telómeros frágiles dependientes de la replicación (Sfeir et al., 2009), y WRN suprime los defectos en la síntesis de cadenas de retardo de telómeros (Crabbe et al., 2004). Drosopoulos et al. (2015) ahora informan que la síntesis de cadenas principales que se inicia dentro del telómero tiene una tasa de progresión más lenta hacia el subtelómero en células con deficiencia de BLM, según lo visualizado por SMARD. Además, hubo una mayor frecuencia de inicio de replicación en el subtelómero 14q de las células con deficiencia de BLM, originándose más cerca del telómero que en las células con dominio de BLM. Estas observaciones sugieren que los orígenes de replicación latentes en el subtelómero 14q se pueden activar cuando se impide la progresión de bifurcación en células con deficiencia de BLM (Fig. 1 C). Drosopoulos et al. (2015) también encontraron un aumento en el inicio de la replicación subtelomérica cuando la progresión de la bifurcación de replicación desde el telómero se vio obstaculizada por la aphidicolina, como un medio alternativo para activar los orígenes latentes por estrés de replicación. Cuando las células se trataron con el estabilizador G4 PhenDC3, la activación de origen subtelomérico de 14q aumentó aún más en las células con deficiencia de BLM. Colectivamente, los datos sugieren una desaceleración de la progresión de la síntesis de la cadena principal a partir de un origen en el telómero 14q (utilizando la cadena parental rica en G como plantilla) cuando las estructuras G4 no se pueden resolver en células con deficiencia de BLM. Como apoyo adicional a la función de la helicasa BLM para eliminar las estructuras G4, hubo un aumento de la tinción en las células con deficiencia de BLM por el anticuerpo BG4 (Biffi et al., 2013) contra G4 en todo el genoma y especialmente en telómeros.

WRN helicase puede desenrollar G4 in vitro (Fry y Loeb, 1999; Mohaghegh et al., 2001). Cuando Drosopoulos et al. (2015) utilizaron SMARD para analizar la replicación en células doblemente deficientes de BLM y WRN, encontraron una marcada disminución de la señal de replicación roja en telómeros 14q, lo que sugiere cierta superposición funcional entre BLM y WRN con respecto a la síntesis de filamentos principales de la cadena rica en G de telómeros. Apoyando esta conclusión, hubo más tinción de G4 por el anticuerpo BG4 en células doblemente deficientes de BLM y WRN que en células deficientes de solo BLM o solo WRN. Esta es la primera demostración directa in vivo de una contribución de las helicasas BLM y WRN en la resolución de estructuras G4, que es especialmente necesaria para la progresión de la síntesis de hebras principales que se inicia en telómeros y se copia de la hebra rica en G.