Queratinas en salud y cáncer: más que meros marcadores de células epiteliales

Marcadores de diagnóstico en tumores epiteliales

Dados los patrones característicos de expresión de queratina dependientes del tipo celular, la diferenciación y el estado funcional en las células epiteliales, la disponibilidad de anticuerpos específicos de queratina y el hecho de que los tumores epiteliales mantienen en gran medida las características de expresión de queratina específica asociadas con el tipo celular respectivo de origen, las queratinas se han utilizado durante mucho tiempo y de manera extensa como marcadores inmunohistoquímicos en patología tumoral diagnóstica (Figura 3; Tabla 1) (Moll et al., 2008).

Queratina expresión en el cáncer humano. Las queratinas normalmente se expresan de forma dependiente del tipo celular, la diferenciación y el estado funcional, y los cánceres epiteliales mantienen en gran medida las características de expresión de queratina asociadas con su respectivo tipo celular de origen, por lo que las queratinas se han reconocido durante mucho tiempo como marcadores diagnósticos en patología tumoral. Aquí se presentan ejemplos de queratinas comúnmente utilizadas en el diagnóstico de neoplasias malignas epiteliales humanas.

Adenocarcinomas, es decir, los cánceres epiteliales que surgen en los tejidos glandulares, comprenden el grupo más grande de neoplasias malignas epiteliales humanas y pueden surgir en diferentes órganos. La capacidad de diferenciar los adenocarcinomas de acuerdo con su tejido de origen es esencial para la selección de los regímenes de tratamiento más apropiados, y las queratinas epiteliales simples son los marcadores utilizados predominantemente para este propósito. La mayoría de los adenocarcinomas expresan queratinas epiteliales simples K8, K18 y K19, mientras que la expresión de K7 y K20 es variable. La tipificación de queratina es de particular importancia diagnóstica en el caso de los adenocarcinomas colorrectales, que, de manera similar al epitelio gastrointestinal normal, casi siempre son positivos para K20, pero negativos para K7 (o tienen una expresión de K7 más baja en comparación con K20) (Moll et al., 2008). Se ha informado que la coexpresión de K20 y K7 es una característica de los cánceres colorrectales más avanzados (Hernández et al., 2005), mientras que se han detectado niveles reducidos de K20 en asociación con una alta inestabilidad de microsatélites (McGregor et al., 2004). Los adenocarcinomas pancreáticos, biliares, esofágicos y gástricos expresan de manera uniforme K7 y más variable, pero hasta el 65%, K20(Chu et al., 2000), mientras que un fenotipo K7+/K20 es característico de los adenocarcinomas ováricos, endometriales y pulmonares (Moll et al., 2008). Los adenocarcinomas endometriales pueden expresar conjuntamente queratinas epiteliales estratificadas, como K5, como indicación de metaplasia escamosa (Chu y Weiss, 2002a). Los carcinomas malignos de glándulas salivales no escamosos también son K7+ / K20 -, con la excepción de los carcinomas de conductos salivales, que pueden ser positivos para ambas queratinas (Nikitakis et al., 2004). Además, casi todos los tumores tiroideos (subtipos folicular, papilar y medular) y dos tercios de los casos de mesotelioma maligno son K7+/K20 -. Estos últimos tumores, a diferencia de la mayoría de los adenocarcinomas, expresan consistentemente queratinas de tipo queratinocito, en particular K5, y vimentina (Yaziji et al., 2006). Los carcinoides apendiculares y pulmonares, los carcinomas corticales suprarrenales, prostáticos y hepatocelulares son negativos para K7 y K20 (Chu y Weiss, 2002b).

La mayoría de los adenocarcinomas de mama, incluidos los subtipos ductal y lobular, expresan constitutivamente K7, K8, K18 y K19. Sin embargo, el K8 presenta un patrón de tinción predominantemente periférico en el carcinoma ductal en comparación con un patrón perinuclear en forma de anillo en el carcinoma lobular (Lehr et al., 2000). En adenocarcinomas pobremente diferenciados que corresponden al subtipo de tipo basal definido por el perfil de expresión basado en microarrays de los tumores de mama (Sorlie et al., 2001), también se expresan queratinas características de las células basales del epitelio estratificado, como K5/6, K14 y K17. Más recientemente, se identificó a phospho(Ser73)-K8 como un posible biomarcador para una expresión más baja de beclin1 y, por lo tanto, un estado de autofagia defectuoso en tumores de mama (Kongara et al., 2010).

La expresión de queratina es una guía particularmente útil para la correcta clasificación de los carcinomas de células renales (RCC) (Liu et al., 2007), como los RCC de células claras expresan principalmente K8 y K18 con una expresión menor de K19, los tumores papilares expresan fuertemente K19 y K7 además del par básico de K8/K18 y los RCC cromófobos típicamente expresan K7 y K8/K18, pero poco K19. Los oncocitomas benignos pueden parecerse histológicamente a los RCC cromófobos, pero son K7 negativos (Liu et al., 2007). Los carcinomas de células de transición generalmente conservan el patrón de queratina urotelial que muestra la expresión combinada de K8 / K18, K7 y K19 junto con K13 y K20 (Moll et al., 1992).

Los carcinomas de células escamosas, independientemente de su sitio de origen, se caracterizan por la expresión de las queratinas epiteliales estratificadas K5, K14 y K17 y las queratinas de tipo queratinocito hiperproliferativas K6 y K16 (Moll et al., 2008). K1 / K10 también pueden expresarse focalmente, y K4 y K13 en menor medida. En los carcinomas de células escamosas poco diferenciados, a menudo se observa coexpresión de las queratinas epiteliales simples K8, K18 y K19.

El uso de queratinas como marcadores diagnósticos en patología tumoral es, con mucho, su aplicación más común en el campo del cáncer. En los casos que no están claros sobre la base de la presentación clínica y la histopatología convencional, incluidos los carcinomas mal diferenciados o que se diseminan por varios órganos y las metástasis del sitio del tumor primario desconocido, la tipificación de queratina es especialmente valiosa para la identificación correcta del tumor y la selección posterior del plan de tratamiento más apropiado.

Marcadores pronósticos en tumores epiteliales

Además de su función bien establecida como marcadores diagnósticos en el cáncer, las queratinas también se han reconocido como indicadores pronósticos en una variedad de neoplasias malignas epiteliales (Tabla 2). Por ejemplo, en el cáncer colorrectal, la expresión reducida de K8 y K20 se ha asociado con la transición de células de cáncer epitelial a mesenquimatoso, lo que generalmente indica una mayor agresividad tumoral y una disminución de la supervivencia de los pacientes (Knosel et al., 2006). Además, la expresión persistente o más alta de un fragmento K18 escindido por caspasa en Asp396 (producido por células epiteliales apoptóticas y detectado por un anticuerpo específico de epítopo M30) en el suero de pacientes con cáncer de colon después de la resección del tumor primario es indicativo de carga tumoral residual sistémica y se correlaciona significativamente con el riesgo de recidiva dentro de los 3 años (Ausch et al., 2009). Los niveles más altos de K18/M30 escindidos en suero antes del tratamiento también predicen una supervivencia más corta en pacientes con cáncer de pulmón (Ulukaya et al., 2007). Más recientemente, se está explorando la relación entre la escisión de caspasa (M30) y el total de K18 (M65), que se determina convenientemente en el suero o plasma utilizando kits de ensayo de inmunoabsorción enzimática disponibles en el mercado, como biomarcador para el monitoreo de la eficacia de la terapia en pacientes con carcinoma (Linder et al., 2010). De manera similar, en pacientes con colangiocarcinoma intrahepático, una concentración sérica alta del fragmento K19 (CYFRA21-1) se relaciona con una disminución de la supervivencia sin recidiva y general (Uenishi et al., 2008). La expresión intratumoral de K20 y la positividad de K20 en la médula ósea y/o la sangre se correlacionan con un peor pronóstico en los adenocarcinomas pancreáticos (Soeth et al., 2005; Matros et al., 2006; Schmitz-Winnenthal et al., 2006). Además, en el cáncer gástrico, la reacción en cadena de la polimerasa con transcripción inversa cuantitativa en tiempo real para K20 en el líquido de lavado peritoneal predice la recurrencia peritoneal en pacientes sometidos a resección con intención curativa (Katsuragi et al., 2007); La positividad de K10 y K19 en carcinomas hepatocelulares es un predictor significativo de una supervivencia general más corta y sin enfermedad después de la resección quirúrgica (Yang et al., 2008); y la ausencia de diferenciación escamosa, como se evidencia por la pérdida de la expresión de K5/6, se asocia con carcinomas endometriales más agresivos y reducción de la supervivencia (Stefansson et al., 2006). En el CCR de células claras, la coexpresión tumoral de K7 y K19 se asocia con la falta de alteraciones citogenéticas, bajo grado nuclear y mejor desenlace clínico (Mertz et al., 2008), mientras que la detección de células tumorales circulantes K8/18 positivas se correlaciona con el estado de los ganglios linfáticos positivos, la presencia de metástasis sincrónicas en el momento de la resección del tumor primario y la supervivencia general deficiente en el cáncer de células renales (Bluemke et al., 2009). La detección de células tumorales diseminadas con queratina positiva en la médula ósea de pacientes con cáncer de próstata antes de la cirugía es un factor de riesgo independiente de metástasis dentro de los 48 meses (Weckermann et al., 2009). En el cáncer de piel, la expresión de queratina en el melanoma maligno es de particular interés, ya que el ARNm K18 se identifica sorprendentemente en un tercio de las muestras de tejido de melanoma y es un factor pronóstico adverso (Chen et al., 2009).

En el cáncer de mama, el subtipo basal definido molecularmente caracterizado por receptor de estrógeno (RE), receptor de progesterona y negatividad del receptor-2 del factor de crecimiento epidérmico humano, pero el receptor del factor de crecimiento y la positividad K5/6 se relacionan con una edad más joven del paciente, un grado tumoral alto y un pronóstico precario, incluso una supervivencia sin enfermedad y general más corta (Cheang et al., 2008; Yamamoto et al., 2009). La expresión de K17 en los tumores de mama también es un pronóstico de resultados clínicos precarios, independientemente del tamaño y grado del tumor en la enfermedad sin ganglios linfáticos (van de Rijn et al., 2002). La detección de células tumorales circulantes con ARNm K19 positivo antes de la quimioterapia adyuvante predice una reducción de la supervivencia sin enfermedad y general en pacientes con tumores de mama tempranos con RE negativo, triple negativo y receptor del factor de crecimiento epidérmico humano 2 positivo (Ignatiadis et al., 2007), mientras que la presencia de células tumorales circulantes con ARNm K19 positivo en la sangre después de completar la quimioterapia adyuvante en mujeres con cáncer de mama temprano de cualquier subtipo indica la presencia de enfermedad residual resistente a la quimioterapia y, de nuevo, se asocia con un mayor riesgo de recurrencia de la enfermedad y una disminución de la supervivencia de las pacientes (Xenidis et al., 2009). El perfil de expresión génica ha indicado que el K18 se regula a la baja con frecuencia en el cáncer de mama metastásico (Hedenfalk et al., 2001; Zajchowski et al., 2001), un hallazgo relacionado con el estadio y grado tumoral avanzado, la micrometástasis de médula ósea y una supervivencia específica y general más corta para el cáncer (Woelfle et al., 2003, 2004). Además, los productos de degradación inmunorreactiva de ubiquitina de K8 y K18 se detectan en carcinomas de mama y pueden determinar la agresividad tumoral (Iwaya et al., 2003).

Función funcional en la génesis tumoral

Dado su papel regulador emergente en la fisiología celular normal y su expresión frecuentemente alterada en el cáncer, surge la pregunta de si las queratinas desempeñan algún papel funcional en la génesis tumoral epitelial. Aunque la mayoría de los ratones transgénicos y KO de queratina no tienen ningún fenotipo tumoral aparente, la deficiencia de K8 (en el fondo de la FVB) resulta en hiperplasia e inflamación colorrectal (Baribault et al., 1994; Habtezion et al., 2005), y también afecta (acorta) la latencia, pero no la incidencia o las características morfológicas de los adenocarcinomas mamarios inducidos por T media de polioma (Baribault et al., 1997); la sobreexpresión de K8 en humanos produce alteraciones neoplásicas tempranas en el páncreas, incluyendo pérdida de la arquitectura acinar, displasia y aumento de la proliferación celular (Casanova et al., 1999), y se correlaciona con la extensión de la lesión pancreática espontánea (Toivola et al., 2008); y finalmente, la expresión ectópica de K8 en la piel causa hiperplasia epidérmica en ratones jóvenes, atipia epidérmica y cambios preneoplásicos en ratones envejecidos, y progresión maligna de tumores benignos de piel inducidos por ensayos químicos de carcinogénesis cutánea (Casanova et al., 2004).

En varios estudios se proporcionaron pruebas que respaldan la función activa de la queratina en la invasión y metástasis de células cancerosas. La transfección de K8 y K18 en células L de ratón, que son fibroblastos y expresan vimentina, da lugar a la formación de filamentos de queratina y se asocia con deformabilidad y mayores capacidades migratorias e invasivas, lo que indica que las queratinas pueden influir en la forma y migración de las células a través de interacciones con el entorno extracelular (Chu et al., 1993). De manera similar, la coexpresión experimental de vimentina y K8/K18 aumenta la invasión y migración del melanoma humano (Chu et al., 1996) y cáncer de mama (Hendrix et al., 1997) cells in vitro.

La incubación de células de cáncer de páncreas humano con esfingosilfosforilcolina, un lípido bioactivo presente en partículas de lipoproteínas de alta densidad y que se encuentra en niveles elevados en la sangre y ascitis maligna de pacientes con cáncer de ovario, induce la reorganización de la queratina a una estructura perinuclear en forma de anillo, que se acompaña de fosforilación K8 y K18 en Ser431 y Ser52, respectivamente (Beil et al., 2003). Este cambio en la arquitectura de la red de queratina resulta en un aumento de la elasticidad celular y una migración celular mejorada, lo que indica que el remodelado de queratina inducido por esfingosilfosforilcolina puede contribuir directamente al potencial metastásico de las células cancerosas epiteliales (Suresh et al., 2005). La deformabilidad celular también aumenta en asociación con alteraciones de la red de queratina debido a la esfingosilfosforilcolina, lo que probablemente resulte en una mayor capacidad de las células cancerosas para invadir el tejido circundante y penetrar a través del estroma, facilitando así su escape del tumor primario (Rolli et al., 2010). Además, trabajos recientes han implicado alteraciones en la fosforilación de queratina como un factor que contribuye a la progresión del cáncer colorrectal, ya que K8 es un sustrato fisiológico de la fosfatasa del hígado regenerador-3, que se sabe promueve la invasividad y el potencial metastásico de las células de cáncer colorrectal, y los niveles altos de fosfatasa del hígado regenerador-3 se asocian con la reducción o pérdida de K8 fosforilado en el frente invasivo de muestras de cáncer colorrectal humano y en metástasis hepáticas (Mizuuchi et al., 2009).

En varios estudios se exploró la función de las queratinas en la invasión de células cancerosas mediante la investigación de la activación del plasminógeno mediado por K8 a la plasmina de la serina proteasa, que participa en el remodelado de la matriz extracelular y, como tal, en la progresión tumoral y la metástasis. El plasminógeno es activado en la superficie celular por el activador del plasminógeno tipo uroquinasa unido al receptor activador del plasminógeno tipo uroquinasa y el dominio C-terminal de K8 que penetra en la membrana celular (dominio ectoplasmático K8), como se muestra en las células de carcinoma hepatocelular y de mama (Hembrough et al., 1995). Aunque es poco probable que la queratina llegue a la superficie celular a través de la vía secretora regular (Riopel et al., 1993), un anticuerpo monoclonal del dominio ectoplásmico K8 previene la unión del activador del plasminógeno tipo uroquinasa e inhibe la generación de plasmina, lo que a su vez resulta en una morfología celular alterada, una mayor adhesión celular a la fibronectina y una reducción del potencial de invasión de células de cáncer de mama (Obermajer et al., 2009), lo que indica que el K8 junto con el activador del plasminógeno tipo uroquinasa, el plasminógeno y la fibronectina forman una plataforma de señalización que puede modular la adhesión celular y la invasividad de las células cancerosas de mama.

K18 puede desempeñar un papel regulador en el cáncer de mama con respuesta hormonal, ya que puede asociarse y secuestrar de manera efectiva el gen diana de ERa y el coactivador de ERa LRP16 en el citoplasma, atenuando así la señalización mediada por ERa y la progresión del ciclo celular estimulado por estrógeno en las células tumorales de mama (Meng et al., 2009). Además, los defectos de autofagia, que promueven la tumorogénesis mamaria(Karantza-Wadsworth et al., 2007), dan como resultado una regulación ascendente de K8, K17 y K19 en células tumorales mamarias de ratón bajo estrés metabólico in vitro y en tumores mamarios de ratón aloinjerto in vivo (Kongara et al., 2010), potencialmente implicando la desregulación de la homeostasis de queratina en el cáncer de mama defectuoso asociado a autofagia, una hipótesis digna de mayor investigación. La autofagia defectuosa también se ha implicado en la acumulación anormal de queratina en el hígado, ya que la formación de inclusión corporal de Mallory–Denk, que es un hallazgo común en los carcinomas hepatocelulares, se ve directamente afectada por la modulación farmacológica de la autofagia (Harada et al., 2008).

La queratina 17, que se induce rápidamente en epitelios estratificados heridos, regula el tamaño y el crecimiento de las células al unirse a la proteína adaptadora 14-3 – 3σ y estimular la vía mTOR, regulando así la síntesis de proteínas (Kim et al., 2006). Estudios en ratones con ablación de todos los genes de queratina proporcionan pruebas adicionales de que las queratinas pueden funcionar antes de mTOR, en los que la letalidad embrionaria por retraso grave del crecimiento se asocia con una localización aberrante de los transportadores de glucosa GLUT1 y GLUT3m, lo que resulta en la activación de la adenosina monofosfato quinasa y la supresión de los objetivos de mTORC1 después de la quinasa S6 y 4E-BP1 (Vijayaraj et al., 2009). En una relación aparentemente recíproca, las isoformas de AKT regulan la expresión de filamentos intermedios en líneas celulares de cáncer epitelial, ya que la sobreexpresión de AKT1 aumenta los niveles de K8/K18 y AKT2 regula al alza K18 y vimentina (Fortier et al., 2010). Por lo tanto, las queratinas, que a menudo se expresan de forma aberrante en los cánceres epiteliales, interactúan de múltiples maneras con la vía AKT/mTOR, que a su vez se activa con frecuencia de forma anormal en tumores agresivos, lo que aumenta la posibilidad de que el papel de AKT en la génesis del tumor epitelial sea mediada por la queratina o dependiente, al menos parcialmente.

Las queratinas también son importantes para la señalización intracelular mediada por chaperona, que a su vez puede desempeñar un papel en la tumorogénesis epitelial. El CPC atípico es un regulador clave de la asimetría celular conservado evolutivamente, que también se ha identificado como un oncógeno causante del cáncer de pulmón de células no pequeñas y un factor predisponente para el cáncer de colon, cuando se sobreexpresa (Fields y Regala, 2007). Trabajos recientes mostraron que tanto las queratinas filamentosas como la proteína de choque térmico 70 son necesarias para la refosforilación de rescate de la PKC atípica madura, regulando así su distribución subcelular y manteniendo sus niveles y actividad de estado estacionario (Mashukova et al., 2009). Además, dado un exceso de proteína de choque térmico soluble 70, se esperaba que la red de queratina fuera un paso limitante de la velocidad en el mecanismo de rescate atípico de PKC, una hipótesis confirmada en dos modelos animales de sobreexpresión de K8 diferentes (Mashukova et al., 2009). En ambos casos, las regiones celulares con acumulación anormal y excesiva de filamentos intermedios también mostraron una señal PKC atípica activa manifiestamente mal localizada, lo que indica que la actividad de la cinasa oncogénica asistida por chaperona, incluida la Akt1, también puede depender de las queratinas y ampliar el conocimiento ya disponible sobre el papel de las queratinas como armazones de chaperona (van den et al., 1999; Toivola et al., 2010).

Aunque las mutaciones K8 se han implicado en la progresión de la enfermedad aguda y crónica (Ku et al., 2001) enfermedad hepática, no se han relacionado directamente con el páncreas hepatocelular (Treiber et al., 2006) o cualquier otro carcinoma. Hasta la fecha, el único tipo de queratina y tumor para el que se ha asociado una variante específica o polimorfismo de un solo nucleótido con predisposición al cáncer es el K5 en el carcinoma de células basales (Stacey et al., 2009), como una exploración de asociación de polimorfismo de un solo nucleótido en todo el genoma para detectar variantes de riesgo comunes de carcinoma de células basales, se identificó que la sustitución G138E en K5 confería susceptibilidad al carcinoma de células basales, pero no al carcinoma de células escamosas, melanoma cutáneo o rasgos de pigmentación clara. Dado el creciente número de estudios de asociación de todo el genoma para diferentes tipos de cáncer, es posible que en un futuro próximo se descubran variantes adicionales de queratina que influyen en el riesgo específico de cáncer.

Papel en la respuesta a los medicamentos

Las queratinas protegen las células epiteliales del estrés mecánico, pero también proporcionan resistencia a otros factores de estrés celular que pueden provocar la muerte celular, incluida la activación de los receptores de muerte y los medicamentos quimioterapéuticos. Por ejemplo, los ratones K8 y K18 nulos, que carecen de filamentos intermedios de queratina en sus hepatocitos debido a la inestabilidad de la queratina cuando falta la queratina de la pareja, y los hepatocitos cultivados ex vivo de ratones K8 nulos son más sensibles a la apoptosis mediada por el Saf que sus homólogos de tipo salvaje (Gilbert et al., 2001). De manera similar, una mutación K18 (Arg89Cys) que interrumpe la red de filamentos de queratina predispone a los hepatocitos a una lesión apoptótica mediada por el Saf, pero no por el factor de necrosis tumoral (Ku et al., 2003b). Estos hallazgos muestran claramente que K8 y K18 median la resistencia a la apoptosis inducida por Saf en el hígado; sin embargo, también pueden ser relevantes para el tratamiento del cáncer, ya que los niveles de queratina se ven afectados por medicamentos contra el cáncer, como la mitoxantrona (MX) (Cress et al., 1988) y doxorrubicina (Hammer et al., 2010), y los agonistas de los receptores proapoptóticos pueden tener actividad antitumoral selectiva, ya que la activación de la vía de muerte extrínseca de las células apoptóticas mediante la unión del ligando 2 de apoptosis/ligando inductor de apoptosis relacionado con el factor de necrosis tumoral a receptores de muerte afines produce apoptosis de diferentes tipos de células cancerosas sin toxicidad significativa para las células normales (Ashkenazi, 2008; Gonzalvez y Ashkenazi, 2010).

Aberrant keratin expression has already been shown to confer a multidrug resistance phenotype, as mouse L fibroblasts are rendered resistant to MX, doxorubicin, methotrexate, melphalan and vincristine, but not to ionizing radiation, upon K8 and K18 transfection (Bauman et al., 1994). Similarly, NIH 3T3 fibroblasts with ectopic K8/K18 expression exhibit resistance to MX, doxorubicin, bleomycin, mitomycin C and melphalan, but not to cisplatin (Anderson et al., 1996). Además, la proteína quimioatractante de monocitos-7 / MX, una línea celular de cáncer de mama humano seleccionada por MX con un fenotipo de resistencia a múltiples medicamentos debido a la sobreexpresión de la proteína resistente al cáncer de mama, también exhibe niveles elevados de K8, que se sinergizan con la proteína resistente al cáncer de mama en el aumento de la resistencia a los medicamentos, probablemente actuando a través de diferentes mecanismos, como el ARN anti-K8 en horquilla corta invierte la resistencia MX sin promover la acumulación intracelular de medicamentos, como lo hace la destrucción de la proteína resistente al cáncer de mama (Liu et al., 2008b). La resistencia a múltiples fármacos de las células de proteína-7/MX quimioatrayente de monocitos se debe, al menos en parte, a su mayor adhesión a la matriz extracelular, que a su vez está mediada por la expresión de K8 en la superficie celular, lo que indica que las alteraciones en el nivel de expresión y la localización celular de K8 pueden disminuir activamente la respuesta al tratamiento del cáncer (Liu et al., 2008a). Queda por explorar si la modulación farmacológica de queratina se puede usar como complemento de la quimioterapia para mejorar los resultados terapéuticos.