Ribosa
6.11.3.2 Modificaciones del Azúcar
Las modificaciones de la ribosa proporcionan un nivel notable de control sobre la conformación del azúcar en el nucleótido, lo que determina la afinidad de unión del ON hacia su cadena complementaria y estructura dúplex. El fruncido de azúcar puede alterarse a través de los efectos anómeros y vagos de los grupos hidroxilos vecinos o a través de restricciones estéricas.56 La mayoría de los azúcares nucleótidos y análogos adoptan conformaciones caracterizadas como » Norte «(C 3′-endo y C 2′-exo), o» Sur «(C 2′-endo y C 3′-exo). En la forma B, más prevalente en el ADN de doble cadena, las ribosas adoptan la conformación «Sur», mientras que en la forma A, más prevalente en el ARN de doble cadena, las ribosas adoptan la conformación «Norte».
El análogo de nucleósido de 2′-O-metilo (2′-O-Me) es una de las modificaciones más utilizadas en la terapéutica ON. En comparación con una hebra de ADN, la incorporación de unidades 2′-O-Me dentro de ONs aumenta la afinidad de unión para los complementos de ARN 57 y aumenta la estabilidad de la nucleasa.58 2 ‘ -O-Me ribosa prefiere una conformación North sugar 59 y forma dúplex en forma A.59b La modificación de 2′-O-Me se ha aplicado ampliamente en la investigación antisentido, especialmente cuando se incorpora en el llamado» gapmer » EN construcciones. Las ONs modificadas de 2’-O-Me se encuentran en muchos ensayos clínicos60 y se pueden encontrar en el primer aptámero aprobado por la FDA, Macugen.61 Estos análogos también son adecuados para la modificación de siRNA. De hecho, las unidades 2 ‘ – O-Me son bien toleradas en siRNAs, 23,27 a, aunque esta modificación no se tolera en todas las ubicaciones del dúplex de ARN, particularmente en la hebra guía.Se ha demostrado que las modificaciones de 62 2 ‘ – O-Me reducen las propiedades inmunoestimuladoras de los ARNip.
La modificación de 2′-O-MOE (2′-O-(2-metoxietil)) se ha utilizado en varios candidatos terapéuticos sometidos a ensayos clínicos.37 Al igual que con 2′-O-Me, la modificación de 2′-O-MOE aumenta la afinidad de unión al objetivo (2°C por inserto)64 y mejora la estabilidad de la nucleasa.las modificaciones de 64a 2′-O-MOE adoptan una conformación de azúcar Norte.los grupos 37,64 a 2′-O-MOE se han aplicado con éxito al antisentido al usar el diseño de gapmer mencionado anteriormente y en siRNA, especialmente en la cadena de pasajeros.65 Una de las terapias antisentido aprobadas, Mipomersen, es una antisentido de segunda generación que contiene enlaces de fosforotioato y azúcares 2′-O-MOE.4a
La modificación de 2 ‘ – fluoro es otra modificación química popular, particularmente para siRNA. el 2 ‘- fluoro, como el 2 ‘-O-Me, es un imitador de ARN, adoptando preferentemente un fruncido de azúcar Norte, 66 al menos en parte debido al fuerte efecto gauche impartido por el 2′-flúor. Al igual que el 2′-O-Me, el 2′-fluoro aumenta la afinidad de unión para las secuencias de ARN diana (2-3°C por inserto versus ADN) 37,64 b,67. La modificación de 2’-Fluoro es muy bien tolerada en el siRNA, tanto en la guía como en las hebras de pasajeros 62b, 68. La sustitución de 2 ‘ – fluoro ha permitido la eliminación completa de los ARN de los ARN SIR sin comprometer la incorporación al RISC, proporcionando así a los dúplex una mayor estabilidad y potencia que aún actúan a través de la activación de la vía del ARNi.69 Como las modificaciones de 2’-O-Me, 2 ‘ – fluoro también se pueden encontrar en el aptámero aprobado por la FDA, Macugen.61
El ácido nucleico bloqueado (LNA) o ácido nucleico bicíclico 2′,4′(2′,4′-BNA) es un análogo de ARN modificado químicamente donde un puente de metileno está formando un enlace covalente entre el 2′-OH y el C-4′ del azúcar.70 Estos análogos de nucleósidos están esencialmente encerrados en una conformación de azúcar Norte que imita de cerca la forma A prevalente en el ARN, que preorganiza efectivamente el LNA para la unión del ARN.70,71 LNA muestra los efectos de estabilidad dúplex más altos de todas las modificaciones químicas, con estabilizaciones de 5-6°C por inserto.70a Como resultado, los LNA han demostrado ser muy útiles en aplicaciones anti-miARN, 72 antisentido ON, 71 y siRNA 62b,73. Las fuertes propiedades de unión del LNA los hacen particularmente útiles en aplicaciones anti-miARN, donde pueden ser necesarias secuencias cortas para la especificidad de miARN. Se encontró que los LNA eran excelentes antisentidos EN las modificaciones cuando se usaban en construcciones de gapmer.74 Modificaciones de LNA también son compatibles con los requisitos químicos de siRNA.73 Las modificaciones del LNA muestran una mejor resistencia a la nucleasa 74 y pueden reducir la respuesta inmunoestimuladora del siRNA.63
A lo largo de los años se han introducido otros ácidos nucleicos bicíclicos (BNAs).65 Un análogo de BNA, que se ha aplicado con éxito a las ONS antisentido terapéuticas de la generación 2.5, es (S)-cEt BNA, donde (S)-cEt BNAS se mezclan en los flancos de 2′-O-MOE de un gapmer MOE. (S)-El tCe y el LNA muestran una Tm y actividades in vitro e in vivo similares. Sin embargo, las ON de (S)-cEt mostraron un perfil de toxicidad mejorado en relación con las ON de LNA. Estos datos sugieren que (S) – cEt BNA tiene el potencial de mejorar el índice terapéutico de los fármacos antisentidos.65 Análogos de nucleósidos a base de bicyclohexano (nucleósidos 2p-desoxi-metanocarba ) adoptan una conformación de azúcar Norte, mejoran la estabilidad térmica de los dúplex y mejoran la estabilidad del suero siRNA.75 Otro análogo nucleósido limitado conformacionalmente, el triciclo-ADN (tc-DNA), ha mostrado ser prometedor en el desarrollo temprano.76 Se basa en un sistema de anillos tricíclicos en lugar de bicíclicos. el tc-ADN muestra una afinidad de unión mejorada al ARN, no activa la RNasa H y es estable a las nucleasas.76
En contraste con la naturaleza rígida del LNA, la modificación de ácido nucleico desbloqueado (UNA) (o «seconucleósido») altamente flexible también se está desarrollando para su aplicación en terapias. UNA, que carece de la unión covalente C2’–C3′ de un azúcar de ribosa, no está conformacionalmente restringida y se puede usar para influir EN la flexibilidad.77 UNA puede reducir la Tm dúplex hasta 5-10°C por inserta77, 78, pero aún así facilita la selección de hebras antisentido en el complejo RISC. Las modificaciones de UNA colocadas en la región de semilla de una hebra guía de ARNip pueden reducir significativamente los efectos fuera de objetivo.79