The Embryo Project Encyclopedia

De 1958 a 1961, Leonard Hayflick y Paul Moorhead en los Estados Unidos desarrollaron una forma en el laboratorio de cultivar cepas de células humanas con juegos completos de cromosomas. Anteriormente, los científicos no podían mantener cultivos celulares con células que tuvieran dos conjuntos completos de cromosomas como las células humanas normales (diploides). Como resultado, los científicos lucharon para estudiar la biología celular humana porque no había una fuente confiable de células que representaran células humanas diploides. En sus experimentos, Hayflick y Moorhead crearon cepas duraderas de células humanas que retuvieron ambos conjuntos completos de cromosomas. A continuación, congelan muestras de los cultivos para que las células sigan siendo viables para la investigación futura. También observaron que las células solo podían dividirse un cierto número de veces antes de degradarse y morir, un fenómeno que posteriormente se llamó el límite de Hayflick. El experimento de Hayflick y Moorhead permitió la investigación sobre biología del desarrollo y vacunas que dependían de cepas de células humanas.

Hayflick se especializó en el cultivo de células en entornos controlados. En 1958,se unió al Instituto Wistar en Filadelfia, Pensilvania, una institución de investigación que estudió biología celular y virus, por invitación del nuevo director del instituto, HilaryKoprowski. Koprowski encargó a Hayflick la creación de cultivos celulares para su uso en los experimentos de otros investigadores del instituto. Hayflicklater recordó, sin embargo, que utilizó su tarea de investigación como una oportunidad para estudiar los métodos y limitaciones de los cultivos celulares. Para ayudar en el cultivo de células, Hayflick reclutó a su colega de Wistar,Paul Moorhead, quien estudió la estructura y función de las células y los cromosomas.

La falta de longevidad de los cultivos de células humanas normales en el laboratorio limitó la investigación que los científicos podían hacer. Con cultivos celulares, los científicos cultivan poblaciones de células en cristalería en condiciones controladas para su uso en investigación. Los investigadores suelen cultivar células en cristalería o placas de petri que contienen medio de crecimiento,una solución que contiene sales disueltas, azúcares y otros nutrientes celulares. A lo largo de la primera mitad del siglo XX,los investigadores plantearon la hipótesis de que todos los cultivos celulares normales y sanos tenían una capacidad innata de dividirse indefinidamente, basándose en hallazgos anteriores publicados por el biólogo Alexis Carrel en 1912 en los Estados Unidos. En la práctica, sin embargo, los investigadores no observaron una división interminable en las células normales.En cambio, las células en cultivo eventualmente se degradaron y murieron. Los científicos plantearon que las células se degradaban porque habían agotado el medio de cultivo de todos sus nutrientes o porque los técnicos de laboratorio no habían logrado mantener las condiciones ambientales ideales para el crecimiento celular. Las únicas células humanas que se dividieron continuamente en entornos de laboratorio, llamadas líneas celulares inmortales, fueron células derivadas de células cancerosas. Esas líneas celulares representaban solo algunos aspectos de la biología celular humana.

A mediados del siglo XX, los investigadores médicos no podían explicar qué causaba el cáncer, y muchos científicos,incluidos Hayflick y Moorhead, plantearon la hipótesis de que ciertos virus podrían causar crecimientos cancerosos. Aunque muchos microbiólogos utilizaban células derivadas de líneas celulares cancerosas en la investigación médica, las células generalmente no se utilizaban en el desarrollo de vacunas porque a los científicos les preocupaba que las vacunas se contaminaran con los virus causantes del cáncer, posiblemente contenidos en las propias células. Además, las células de líneas cancerosas, debido a su división constante, eran heteroploides, lo que significa que tenían un mayor o menor número de cromosomas que las células humanas normales, que tienen dos conjuntos completos de cromosomas. Las células heteroploides a menudo resultaron de la división celular continua a lo largo de muchas generaciones de células en cultivo.

Hayflick y Moorehead produjeron células humanas que podían cultivarse a lo largo de muchas generaciones, como células de líneas celulares cancerosas, pero también preservaron el número diploide de cromosomas de las células y redujeron el riesgo de virus teóricos causantes de cáncer. Describieron su experimento en «The Serial Cultivation of Human DiploidCell Strains», publicado en 1961.

Hayflick y Moorhead buscaron desarrollar cepas de células humanas que pudieran cultivarse durante largos períodos de tiempo en el laboratorio, pero que aún conservaran su número diploide de cromosomas. Plantearon la hipótesis de que si se trasplantaban pequeñas muestras de células humanas diploides de cultivos ya en crecimiento a un nuevo entorno de crecimiento, aumentarían en gran medida el número de células diploides en cultivo. Hayflick y Moorhead propusieron que congelar pequeñas cantidades de células diploides pausaría el crecimiento y la división de las células sin destruir las células. Las células congeladas podrían almacenarse hasta que los investigadores las necesitaran, momento en el que podrían cortar las células congeladas, restaurándolas a la actividad celular normal.Hayflick y Moorhead predijeron que después de la descongelación, esas células cultivadas no se convertirían en heteroploides como células de otras líneas y conservarían su conjunto diploide de cromosomas.

El experimento de Hayflick y Moorhead tenía como objetivo crear un método para cultivar células diploides humanas en el laboratorio para uso de investigación a largo plazo, y determinar si esas cepas celulares contribuyeron o no a los crecimientos cancerosos.Hayflick y Moorhead primero cultivaron células humanas en cultivos de laboratorio, trasplantaron pequeñas muestras de células en recipientes nuevos para cultivar células adicionales y congelaron muestras de células de esos cultivos para preservarlas para investigaciones posteriores. A continuación, para probar si las células congeladas aún eran viables para la investigación, Hayflick y Moorheadtaron las células congeladas e intentaron cultivar células a partir de ellas.Finalmente, implantaron muestras de esas cepas de células diploides humanas en tejidos vivos para ver si provocaban tumores cancerosos.

Para desarrollar cepas celulares humanas diploides, Hayflick y Moorhead comenzaron a cultivar células de 25 tejidos diferentes recuperados de fetos abortados. Estas células se convirtieron en 25 cepas de células humanas diferentes, llamadas numéricamente WI-1 a través de WI-25. El WI significaba Instituto Wistar, donde se desarrollaron las bandas celulares. Hayflick y Moorhead usaron tejidos fetales porque, más que las células adultas, las células fetales se desarrollaron más fácilmente en células de fibroblastos, que son células especializadas que proporcionan soporte estructural a la mayoría de los tejidos corporales. Las células de fibroblastos eran preferibles para el cultivo de células de laboratorio porque crecían rápida y continuamente en cultivos celulares, proporcionando una abundancia de células para la investigación. Hayflick y Moorhead cortaron cada una de las muestras de tejido en astillas pequeñas y finas y luego las implantaron en la pared interna de botellas de vidrio llenas de medio de crecimiento rico en nutrientes. Hayflick y Moorheadentonces colocaron las botellas recubiertas de tejido de cada cepa celular en un ambiente cálido durante tres días, reemplazando regularmente el medio de crecimiento con un suministro fresco, para comenzar a cultivar el cultivo celular.

Hayflick y Moorhead permiten que los cultivos crezcan hasta que las células cubran toda la botella de vidrio. Cada muestra de células fetales fue subdividida por un proceso llamado subcultivo. Durante el subcultivo, Hayflick y Moorhead retiraron una pequeña muestra de células e implantaron esas células en la pared de un nuevo frasco de vidrio lleno de medio de crecimiento, creando un nuevo cultivo de células de la misma cepa celular. Cada nuevo cultivo de células constituyó una nueva generación de células que, a su vez, podían seguir cultivándose con el mismo método, lo que permitía que el número total de células creciera exponencialmente. Hayflick y Moorhead dividieron las muestras de las células restantes en pequeñas porciones y las congelaron para detener el crecimiento de las células y detener cualquier división celular adicional.

Hayflick y Moorheadcontinuaron subcultivando células dos veces a la semana durante unos diez meses, momento en el que los cultivos celulares dejaron de crecer y comenzaron a degradarse.Hayflick y Moorhead plantearon la hipótesis de que las células habían dejado de dividirse debido a la acumulación de productos tóxicos del crecimiento celular en el medio de crecimiento. Hayflick y Moorhead intentaron introducir un medio de cultivo fresco que estuviera libre de cualquier posible toxina, pero los cultivos celulares continuaron degradándose y muriendo durante los siguientes meses. Sin embargo, otros cultivos celulares colocados en el mismo medio de crecimiento no se degradaron ni murieron. Los investigadores concluyeron que algo relacionado con las células mismas, no con su entorno, hizo que comenzaran a deteriorarse.

Hayflick y Moorhead intentaron determinar si las células que habían congelado aún podían usarse para cultivar más células. Después de descongelar pequeñas muestras de células, Hayflick y Moorheadimplantaron las células en las paredes de botellas de vidrio. Las cultivaron de nuevo en medios de crecimiento y descubrieron que, incluso después de congelarse, las células seguían creciendo en nuevos cultivos, que podrían ser subcultivados. Independientemente de la congelación o subcultivos previos, los investigadores podrían usar muestras de cultivos de células humanas diploides para cultivar más cultivos de células humanas diploides. Hayflick y Moorhead habían creado una cepa de células humanas adiploides que podía cultivarse en cultivos de laboratorio casi indefinidamente.

Hayflick y Moorhead investigaron entonces si las células cultivadas en los nuevos cultivos eran diploides o no. Al escribir sobre el experimento, dijeron que les preocupaba que las células no hubieran permanecido diploides porque las habían cultivado a lo largo de muchas generaciones, lo que puede llevar a la heteroploidía. Usando microscopios de luz, Hayflick y Moorhead observaron muestras de células durante la metafase de la división celular, cuando los cromosomas son distintos y se observan fácilmente. Contaron el número de cromosomas en 250 células individuales para obtener una estimación de cuántas células aún tenían el número adiploide de cromosomas. Hayflick y Moorhead determinaron que más del 97 por ciento de las células eran diploides incluso después de más de veinte generaciones de subcultivos. Hayflick y Moorhead concluyeron que su proceso de cultivo en serie y congelación de células fetales era un método eficaz para preservar una cepa de células humanas diploides.

Finalmente,Hayflick y Moorhead necesitaban demostrar que sus cepas celulares no causaban cáncer. El problema con las líneas celulares inmortales creadas a partir de células cancerosas fue que los investigadores plantearon la hipótesis de que las células podrían contener virus causantes de cáncer. Para asegurarse de que sus nuevas cepas de células no causaran cáncer, Hayflick y Moorhead probaron la cepa celular WI-25 en tejido vivo. Seleccionaron la cepa WI-25 porque había sufrido la mayor cantidad de subdivisiones y era la cepa celular con mayor probabilidad de causar cáncer. Por lo tanto, si no lo hacía, era probable que ninguna de las otras cepas lo hiciera.

Los investigadores implantaron células de la cepa celular WI-25 en las bolsas de las mejillas de cinco camioneros vivos. Como grupo de control experimental, también implantaron cinco bolsas de mejillas de hámsters con células derivadas de líneas celulares cancerosas. Al principio, aparecieron nódulos, un signo temprano de cáncer en desarrollo, en las bolsas de chequeo de ambos grupos de hámsters. Sin embargo, después de tres semanas, casi todos los nódulos en los hámsters implantados con células WI-25 habían desaparecido, mientras que los nódulos en los hámsters implantados con células de líneas de células cancerosas habían aumentado de tamaño. Hayflick y Moorhead realizaron biopsias de los nódulos restantes para confirmar su predicción de que sus células subcultivadas no causaban cáncer.Las biopsias mostraron que los nódulos en hámsters implantados con células de líneas celulares cancerosas eran cancerosos, mientras que los nódulos celulares WI-25 se debían a inflamación y sangrado en el lugar de implantación.

Hayflick y Moorhead también implantaron un trenzado celular humano similar, WI-1, en los tejidos musculares de cinco pacientes de cáncer moribundos.También implantó células de líneas celulares cancerosas en otros cinco pacientes con cáncer terminal. Al igual que en los hámsteres, en un primer momento los nódulos invaden los sitios de implantación de ambos grupos. Después de un par de días, los nódulos celulares WI-1 comenzaron a retroceder, mientras que los nódulos se multiplicaron en los pacientes hospitalizados implantados con células de líneas celulares cancerosas. Al final de la semana, casi todos los nódulos WI-1 habían desaparecido, y Hayflick y Moorhead hicieron biopsias de los nódulos restantes en ambos grupos. Los resultados de las biopsias mostraron que los nódulos celulares cancerosos eran células heteroploideas, mientras que los nódulos WI-1 eran diploides y no cancerosos. Los hallazgos de Hayflick y Moorhead, que publicaron en 1961, demostraron que las células diploides humanas podían propagarse a lo largo de muchas generaciones,como líneas celulares cancerosas, sin convertirse en heteroploides o cancerosas.

Los resultados tuvieron un impacto inmediato y duradero en la comprensión de la biología del desarrollo y la investigación científica. Los resultados de su experimento no confirmaron la hipótesis de Carrel de 1912 de que las células normales crecieron indefinidamente en cultivo, a pesar de las observaciones de cultivos celulares degradándose con el tiempo. Carrel había sugerido que, por lo tanto, las células, en la práctica, parecían deteriorarse y envejecer con el tiempo se debía a condiciones de crecimiento de laboratorio imperfectas para las células.Carrel afirmó que en condiciones ideales, las células en los cultivos podrían dividirse indefinidamente, actuando efectivamente como una línea celular inmortal.Sin embargo, los hallazgos de Hayflick y Moorhead indicaron que los inorganismos de envejecimiento ocurren a nivel celular, un proceso llamado senescencia, y que las células solo podían sufrir un número limitado de divisiones antes de degradarse y morir. Durante su experimento, Hayflick y Moorhead intentaron cultivar continuamente células fetales, reemplazando el medio de crecimiento viejo por medio fresco y rico en nutrientes. Sin embargo, descubrieron que después de unas cuarenta o sesenta generaciones, las células comenzaron a morir antes de reproducirse, un fenómeno que más tarde se llamó el límite de Hayflick. Este resultado demostró que las células no podían crecer indefinidamente en cultivo, ni siquiera en condiciones ideales.

El método de cultivo en serie de células diploides humanas de Hayflick y Moorhead también ayudó a los científicos a mantener un suministro abundante de células diploides humanas para la investigación. Según los cálculos de Jay Flick y Moorhead, una sola cepa de células humanas podría ser subcultivada suficientes veces para producir casi 20 toneladas métricas de células viables. Aunque no era técnicamente inmortal, ese suministro se convertiría en inagotable para fines de investigación práctica.

Además, la creación de células humanas diploides viables permitió la investigación de vacunas.Debido a que Hayflick y Moorhead demostraron que sus cepas de células humanas no causaban cáncer en hámsters ni en humanos, esas cepas podrían usarse invacunadas sin la amenaza de contaminar la vacuna con algún agente causante de cáncer. Cepas posteriores de células humanas de origen similar, como WI-38, se convirtieron en la base para vacunas para enfermedades infantiles como la rubéola y la varicela.

Mientras que muchos investigadores dieron la bienvenida al desarrollo de cepas de células humanas por Hayflick y Moorhead, algunos, incluida la Iglesia Católica, desaprobaron el uso de material fetal abortado en el desarrollo de vacunas por motivos religiosos. El Vatican declaró más tarde que se opusieron al método de desarrollo de vacunas derivadas de tejidos fetales, no al uso individual de esas vacunas para prevenir enfermedades.

Hayflick y Moorhead demostraron no solo que las células humanas podían cultivarse con éxito en el laboratorio mientras mantenían un número diploide de cromosomas,sino también que podían mantener las células casi indefinidamente a través de un subcultivo en serie. Además, su experimento sentó las bases para que Hayflick investigara más a fondo el límite de división celular en el cultivo, más tarde llamado límite de Hayflick. Los descubrimientos de Hayflick y Moorhead permitieron nuevos experimentos en biología del desarrollo y desarrollo de vacunas al proporcionar abundantes células humanas para la investigación.