molekuláris felismerés indukált illesztéssel: mennyire illik a koncepció?
gyakorlatilag minden biológiai jelenség valamilyen módon függ a specifikus molekuláris felismeréstől. A 19.század végén Emil Fischer megalkotta híres zár-kulcs analógiáját az enzimreakciók specifikusságának ábrázolására, amelyek az élet molekuláris előfeltételei (4). Az enzimet merev sablonnak tekintették, amelyben a szubsztrátumnak kulcsként kellett illeszkednie egy zárba. Az évek során azonban nyilvánvalóvá vált, hogy az előformált molekuláris struktúrák közötti merev illeszkedés nem magyarázza meg az enzimkatalízis minden aspektusát. Például, miért nem illeszkedik egy kisebb szubsztrát egy nagyobb szubsztrátumhoz tervezett enzim aktív helyére? Vagy miért vannak egyes enzimek nagyon szelektívek, de mások több szerkezetileg különböző szubsztrátmolekulát képesek befogadni?
ebben az összefüggésben több mint 40 évvel ezelőtt Daniel Koshland megfogalmazta az indukált illeszkedés fogalmát (7). Az enzimatikus reakció megkönnyítése érdekében pontos illeszkedés hiányában azt feltételezte, hogy” a szubsztrát észrevehető változást okozhat az aminosavak háromdimenziós kapcsolatában az aktív helyen ” (7). A pontos illeszkedés gondolatát megtartották a zár-kulcs képből, de kifejezetten kijelentették, hogy az illesztés “csak a hordozó által kiváltott változások után következik be” (hangsúly eredeti). A koncepció hamarosan tankönyvi ismeretekké vált, és azóta mindenféle molekuláris felismerési folyamat magyarázatára használják, messze túl az enzim-szubsztrát reakciókon. Valójában a kölcsönhatásban lévő biomolekulák szerkezeti elemzése újra és újra megállapította, hogy egy komplex és szabad komponens molekulái eltérhetnek a szerkezet finom részleteiben, az indukált illeszkedés általi felismerés nyilvánvaló támogatásában. Jó példát szolgáltat számos antigén-antitest komplex, amelyek térbeli alkalmazkodását nagy felbontású kristályszerkezet-elemzéssel igazolták (2). A szerkezeti plaszticitás más fehérje-fehérje kölcsönhatásokban is nyilvánvaló (12).
miért kellene megkérdőjelezni egy régi koncepciót? Ennek oka az, hogy az indukált illesztési paragon gyakran túl készen áll arra, hogy megmagyarázza, miért kölcsönhatásba lépnek a látszólagos szerkezeti komplementaritás nélküli molekulák. A probléma abban az eredeti feltételezésben rejlik, hogy a kedvező illeszkedés csak a kezdeti kötés után alakul ki, amelyet gyakran túl szó szerint vesznek. Figyelembe véve a kötési reakció kinetikáját és termodinamikáját, az indukált illesztés csak akkor lehetséges, ha a kölcsönhatásban lévő helyek közötti egyezés elég erős ahhoz, hogy a kezdeti komplex elég erős és hosszú élettartamot biztosítson ahhoz, hogy az indukált illesztés ésszerű időn belül megtörténjen. Ezt a kritikus pontot egy egyszerű modellszámítással szeretném illusztrálni, amely az ábrán látható termodinamikai cikluson alapul. 1. Vegyük figyelembe az A és B molekulákat, amelyek lehetnek enzim és szubsztrát, antigén és antitest, hormon és receptor, vagy bármely más kölcsönhatásban lévő molekula. Az egyszerűség kedvéért azt is feltételezem, hogy az indukált illeszkedés csak a B molekulában fordul elő, amelyet B* – ra változtatunk, hogy az AB*stabil komplexet képezzük. (Ez a feltételezés nem befolyásolja a számítás eredményét, de leegyszerűsíti a matematikai formalizmust.) Az indukált illeszkedéssel történő kötődést az ábra 1.és 2. reakciója írja le. 1. Az 1. reakcióban a és B kölcsönhatásba lépve az AB kezdeti komplexet alkotja, amely egy lazán kötött molekulapár. Pontos és energetikailag kedvező kölcsönhatások alakulnak ki a 2. reakcióban, amelyben B az indukált fit hatására B * konformációba kényszerül. A B “húzásának” és “tolásának” energiája az illesztési konformációba az AB*végső komplexben elért optimalizált illesztésből származik. Az AB * komplex teljes kötési állandója K = K1 Kb K2 = k1 kb K2/k–1 KB k–2 (Lásd az ábrát. 1 a kötési állandók és a kinetikus sebességállandókmeghatározásához).
1. ábra. Termodinamikai ciklus az A és B molekulák reakciójára az AB * komplexre, ahol B és B * ugyanazon molekula különböző konformációs állapotai. Az indukált illesztési útvonal az 1.és 2. reakciót követi. Az 1. reakcióban képződött AB kezdeti komplex nem stabil, mert a B konformációja nincs optimalizálva. A 2 indukált illesztési reakció B-t hoz a B*illesztési konformációba. A konformációs szelekciós útvonal a 3.és 4. reakciót követi. A 3. reakció a nem illeszkedő B konformáció és a B * illesztési konformáció közötti konformációs egyensúlyt írja le. A 4. reakció a B* illesztési konformáció a-hoz való kötődése.az indukált illesztési útvonal kinetikailag csak akkor Kompetens, ha az AB komplex érzékelhető stabilitással rendelkezik, így az indukált illesztésnek ésszerű esélye van. Ha nem ez a helyzet, és az a hiányában kis mennyiségű B* illesztési konformáció van jelen, akkor a konformációs szelekciós útvonal dominál.
gyakorlati példaként képzeljen el egy antigén-antitest komplexet, amelynek k jellemzően 108 M–1 nagyságrendű. Mivel az 1. reakció kedvezőtlen, a K1–et 1 M–1-nek veszem, ebből következik, hogy K2 = 108 M-1. Mivel K2 >> K1, az egyensúly az AB*antigén-antitest komplex oldalán van. Például, ha 1 10-6 m-es antitest 1 10-6 m-es antigénnel reagál, akkor a termodinamikai egyensúly 91% az antigén-antitest komplex oldalán (k = 108 M–1 és total = total = 1 10-6 m, ahol a szögletes zárójelek a koncentrációt jelzik). A fontos kérdés, amelyet gyakran figyelmen kívül hagynak, az, hogy mennyi ideig tart az egyensúlyi koncentráció elérése. Az időfolyamat leírása:
1 
2 az egyensúly eléréséhez szükséges idő kiszámításához ésszerű K1 és k2 becslésekre van szükség (a k–1 és k–2 a kiválasztott K1 és K2 értékekből következik; Lásd az ábrát. 1). A nagyon gyenge komplex képződési sebessége 102 és 106 M–1•s–1 között lehet. A k1 = 104 M–1•s–1-et választom; a k1 értéke azonban nincs nagy hatással a számítás eredményére. A fehérjék konformációs változásai milliszekundum felezési ideje van, ezért k2 = 102 s–1-et választok (félidő = 7 ms, ln2/k2-től). A hátreakciók megfelelő értékei ekkor k–1 = 104 s–1 és k–2 = 10-6 s–1. Az 1. és 2. egyenletek numerikus integrálása a fenti sebességállandókra és az 1. számú 10-6 m-es kiindulási antigén-és antitest-koncentrációra az antigén-antitest komplex kialakulásának felezési ideje ~2,5 óra. így az egyensúly elérése ~1 napot vesz igénybe (~10 felezési idő). Ennek a hosszú reakcióidőnek az az oka, hogy miután kialakult, az instabil AB antigén-antitest komplexnek csak nagyon kis esélye van arra, hogy az indukált fit átmenetet az AB stabil antigén-antitest komplexre*végezze. Az indukált illeszkedés, bár termodinamikailag ésszerű, túl lassú ahhoz, hogy biológiai reakcióként értelmezhető legyen.
A konformációs szelekció az indukált illeszkedés alternatívája
más kutatók, köztük én is (1, 3, 5, 8, 13, 14) rámutattak, hogy van egy alternatív mechanizmus indukált fit. A konformációs szelekció lényege, amelyet az ábra 3. és 4. reakciója ír le. 1, az, hogy feltételezzük, hogy a konformációváltozás nem következik be a kezdeti kötés után. Ez meglehetősen nyilvánvaló feltételezés. Vegyük az AB * antigén-antitest komplexet. A 4. reakció révén szabad a antitestre és szabad B* antigénre disszociál. Ezért a B* elszigetelten fordul elő, annak ellenére, hogy csak rövid életű kisebbségi konformáció lehet, amely a 3.reakció révén gyorsan egyensúlyba kerül a B fő konformációval. Annak kiszámításához, hogy mennyi ideig tart az AB* egyensúlyi koncentrációjának elérése konformációs szelekcióval, feltételezem, hogy ezer molekula közül egy B* konformációban van (K3 = 10-3). Ebből következik, hogy K4 = 1011 M–1 Az ábra termodinamikai ciklusa óta. Az 1-nek teljesülnie kell a K1–esek szerint kb K2 = K3-asok szerint kb K4 = K = 108 M-1. Azt is feltételezem, hogy a konformációs változás B A B* olyan gyors, mint az indukált illeszkedés (k2 = k3 = 100 s–1). Ezenkívül szükség van a B* asszociációs sebességének értékére A a reakcióban 4. Az antigén-antitest kötődés mért sebességállandói a 104-107 M–1•s tartományban vannak–1 (8, 9, 11). A K4 = 106 m–1•s–1 középső értékét választom. Ilyen körülmények között az AB* antigén-antitest komplex képződése a 3.és 4. reakción keresztül csak 80 másodperc; az AB* egyensúlyi koncentrációja <15 perc alatt érhető el.
Ezek a számítások azt mutatják, hogy az indukált illesztéssel történő kötésnek csak akkor van értelme, ha a kölcsönhatásban lévő Fajok között bizonyos mértékű már meglévő komplementaritás van; egyébként a kezdeti komplex AB túl rövid életű (feltételezés implicit Koshland kezdeti papír). A fenti K1 és k2 előremenő sebességi állandók és 1 10-6 m kezdeti koncentrációk alkalmazásával megállapíthatjuk, hogy a K1–nek ~104 M-1-nek kell lennie ahhoz, hogy az indukált illesztési útvonalon ugyanazt a 80 másodperces felezési időt érje el, mint a konformációs szelekciós útvonalon.
A kötés kísérleti demonstrációja konformációs szelekcióval
meglepően kevés tanulmány próbálta kimutatni a konformációs szelekciót annak ellenére, hogy könnyebben kimutatható, mint az indukált illeszkedés (1, 5, 8, 15). Az indukált illeszkedés bizonyításához a kötési reakció során szerkezeti információkat kell mintát venni, ami meglehetősen nehéz feladat. A konformációs szelekció bizonyításához meg kell mutatni, hogy az AB* komplex képződési sebessége lineárisan arányos a B* illesztési konformer koncentrációjával, és nemlineárisan arányos a B + B*teljes koncentrációjával. Ha meg tudjuk mérni a 3 konformációs egyensúlyi reakciót az a kötő partner hiányában, kiszámíthatjuk a B * koncentrációját és megjósolhatjuk az AB*képződésének teljes sebességét.
egy jól tanulmányozott példa az egyláncú antitest fragmens reakciója, amely a 33 maradék hosszú prolintartalmú gcn4-7P14P peptid ellen irányul, röviden P peptidnek nevezzük (6). A peptid szekvenciájában nagyon hasonló az élesztő transzkripciós aktivátor leucin cipzár doménjéhez GCN4, azzal a különbséggel, hogy nem képez leucin cipzárt, mert két prolinmaradékot tartalmaz. (A prolinek nem kompatibilisek a leucin cipzár spirális konformációjával,amely a spirálok dimerje egymás körül.) Azonban az antitest keresztreakcióba lép a GCN4 leucin cipzárral, és ez a keresztreakció egyértelműen konformációs szelekciós utat követ. Az antitest reagál a kibontott peptiddel, amelyet a hajtogatott leucin cipzárból szállítunk (3.reakció). Összehasonlítva az antitest eredeti reakcióját P P-vel a gcn4 leucin cipzárral való keresztreakcióval, elvárható, hogy a keresztreakció lassabb legyen, mivel az antitestnek kis mennyiségű kibontott peptidet kell kiválasztania egyensúlyban nagy mennyiségű összehajtott leucin cipzárral. Ezenkívül a túlnyomórészt hajtogatott leucin cipzárral történő keresztreakció sebessége nemlineáris függőséget mutat a teljes antigénkoncentrációtól, ugyanakkor lineáris függést mutat a kis mennyiségű kibontott peptid koncentrációjától (8, 15). Nem ez lenne a helyzet egy indukált illesztési mechanizmus esetében, amelynek kétfázisúnak kell lennie, az első fázis egy bimolekuláris asszociációs reakciónak felel meg, amelynek sebessége lineárisan függ a teljes antigénkoncentrációtól, a második fázis pedig egy koncentráció-független konformációs átrendeződéstől. A 2. ábra a tényleges adatokat mutatja. Az antigén-antitest komplex képződésének sebessége lineárisan függ a kis mennyiségű kibontott peptid koncentrációjától, nemlineárisan pedig a teljes antigénkoncentrációtól (ábra. 2A). A 2B. ábra az eredeti antigénnel való gyorsabb reakció kinetikai nyomait, a gcn4 leucin cipzárral pedig a lassabb reakciót mutatja. Ennek ellenére a kibontott leucin cipzár konformációs kiválasztása még mindig nagyságrendekkel gyorsabb, mint egy indukált illesztési út, mert az antitest kötődése a hajtogatott leucin cipzárhoz (ábra 1.reakciója. 1) rendkívül gyenge (1).
2. ábra. A c11l34ser antitest keresztreakciójának kinetikája a leucin cipzárral GCN4. V: A gcn4-gyel való keresztreakció sebessége lineárisan arányos a kibontott peptid koncentrációjával, amelyet az ábrán a 3.reakció K3-jából számítunk ki. (1) és nemlineárisan arányos az antigén teljes koncentrációjával ( • ), a konformációs szelekciós útvonal előrejelzésének megfelelően. B: az eredeti peptiddel való reakció sebessége gyorsabb, mint a gcn4-gyel való keresztreakció sebessége, amint azt a konformációs szelekciós útvonalra előre jelezték 3 a 6. ábrán. 1. A nyomok 4 10-7 m-es antitest 4 10-6 m-es gcn4-7p14p (peptid P) és 4 10-6 m-es gcn4 reakciójára vonatkoznak. Az adatokat a Ref. 1 engedélyével.
A fehérje konformáció energia tájmodellje
a hajtogatott fehérjék nem rendelkeznek egyetlen egyedi szerkezettel, de jobban tekinthetők hasonló, hasonló energiatartalmú struktúrák nagy együttesének. Ezek az úgynevezett konformerek gyorsan ingadoznak egymással (10). Ha az energia táj sima, a sok konformer gyorsan cserélődik. Ha robusztus, akkor az együttes tartalmazhat olyan konformereket, amelyek meglehetősen eltérőek lehetnek, és lassabban cserélhetők. Így a B és B * struktúrák közötti kiválasztás nagymértékben leegyszerűsített nézet. A valóságban ez inkább olyan, mint egy válogatás nagyon sok többé-kevésbé illeszkedő szerkezet között (13). A konformációs szelekció végeredménye azonban ugyanaz: azok a konformerek kötődnek a legjobban, amelyek a legjobban illeszkednek.
következtetések
a Konformációs szelekció az indukált illeszkedés értékes alternatívája. Ez nem azt jelenti, hogy az indukált illesztéssel történő kötés nem fordul elő. Valójában a konformációs szelekció és az indukált illeszkedés kombinációja tűnik a legjobb leírásnak a molekulák közötti kölcsönhatásról, amelyek nyilvánvalóan nem optimálisan illeszkednek. Elképzelhetjük a részben illeszkedő struktúrák közötti szelekciót, majd a végső stabil komplexum kisebb kiigazításait (amely a tájelmélet szerint maga is hasonló konformerek együttese). A lényeg az, hogy az indukált illeszkedés nem lehet gyógymód, amint azt az irodalom gyakran állítja. Az indukált illeszkedés némi előzetes molekuláris egyezést igényel, hogy elegendő affinitást biztosítson a konformációs alkalmazkodás előtt. Ha ez a feltétel nem teljesül, az indukált illeszkedés kinetikus szűk keresztmetszetbe vezet, még akkor is, ha az általános reakció termodinamikailag megvalósítható.
hálás vagyok sok korábbi és jelenlegi kollégámnak a segítőkész és ösztönző beszélgetésekért.
a laboratóriumom munkáját részben a Svájci Nemzeti Tudományos Alapítvány támogatta.
- 1 Berger C, Weber-Bornhauser S, Eggenberger J, Hanes J, pl. Antigén felismerés konformációs szelekcióval. FEBS Lett 450: 149-153, 1999.
Crossref / Isi / Google Scholar - 2 Davies DR és Cohen GH. A fehérje antigének kölcsönhatása antitestekkel. Az Amerikai Tudományos Akadémia 93: 7-12, 1996.
Crossref / ISI/Google Scholar - 3 D Bctiprr e és Bosshard HR. egy monoklonális antitest indukálja a tekercselt tekercs megnyitását—az amid protonok H / D csere elleni globális védelme akár 1000-szeresére csökken az antitesthez kötött hármas szálú tekercsben. Eur J Biochem 249: 325-329, 1997.
Crossref / Google Scholar - 4 Fischer E. A konfigurációs adatok az enzimet érintik. Ber Dtsch Chem Ges 27: 2984-2993, 1894.
Google Scholar - 5 Foote J és Milstein C. konformációs izomerizmus és az antitestek sokfélesége. Az Amerikai Tudományos Akadémia 91: 10370-10374, 1994.
Crossref / Isi/Google Scholar - 6 Hanes J, Jermutus L, Weber-Bornhauser S, Bosshard HR és pl. A. a riboszóma kijelző hatékonyan választja ki és fejleszti ki a nagy affinitású antitesteket in vitro az immunkönyvtárakból. Az Amerikai Tudományos Akadémia 95: 14130-14135, 1998.
Crossref / Isi / Google Scholar - 7 Koshland de Jr. Az enzimspecifitás elméletének alkalmazása a fehérjeszintézisre. Az Amerikai Egyesült Államok 44: 98-104, 1958.
Crossref / ISI/Google Scholar - 8 Leder L, Berger C, Bornhauser S, Wendt H, Ackermann F, Jelesarov I és Bosshard HR. a konformációs adaptáció spektroszkópiai, kalorimetriás és kinetikai demonstrációja a peptid-antitest felismerésben. Biokémia 34: 16509-16518, 1995.
Crossref / Isi / Google Scholar - 9 Mason DW és Williams Af. Az antitestreakciók kinetikája és a sejtfelszíni antigének elemzése. In: kísérleti immunológia kézikönyve (4. kiadás.), szerkesztette a Weir DM, a Herzenberg LA, A Blackwell C és a Herzenberg LA. Oxford: Blackwell Scientific, 1986, p. 38.1–38.17.
Google Scholar - 10 Onuchic JN, Nymeyer H, Garcia AE, Chahine J és Socci ND. A fehérje hajtogatásának energetikai tájelmélete: betekintés a hajtogatási mechanizmusokba és forgatókönyvekbe. Adv Protein Chem 53: 87-152, 2000.
Crossref / Google Scholar - 11 Raman CS, Jemmerson R, Nall BT és Allen MJ. Diffúziós korlátozott arányok a citokrómhoz kötődő monoklonális antitestekhez C. Biokémia 31: 10370-10379, 1992.
Crossref / Isi/Google Scholar - 12 Sundberg EJ és Mariuzza RA. Luxus Szállások: a strukturális plaszticitás növekvő szerepe a fehérje-fehérje kölcsönhatásokban. Szerkezet 8: R137-R142, 2000.
Crossref / ISI/Google Scholar - 13 Tsai CJ, Ma BY, és Nussinov R. összecsukható és kötelező kaszkádok: eltolódások energia tájak. Az Amerikai Tudományos Akadémia 96: 9970-9972, 1999.
Crossref / Isi / Google Scholar - 14 van Regenmortel MHV. Az immunológia szerkezeti paradigmájának túllépése-az affinitás és a biológiai aktivitás, nem pedig pusztán strukturális megfontolások vezérlik a szintetikus peptid-epitópok tervezését. Biomed Pept Fehérjék Nukleinsavak 1: 109-116, 1995.
Google Scholar - 15 Zeder-Lutz G, van Regenmortel MHV, Wenger R és Altschuh D. a ciklosporin A és két ciklosporin analóg kölcsönhatása a ciklofilinnel: kapcsolat a szerkezet és a kötés között. J Kromatogr B Biomed Appl 662: 301-306, 1994.
Crossref / Isi / Google Scholar