Riconoscimento molecolare per adattamento indotto: quanto è adatto il concetto?
Praticamente tutti i fenomeni biologici dipendono in un modo o nell’altro da uno specifico riconoscimento molecolare. Alla fine del 19 ° secolo, Emil Fischer coniò la sua famosa analogia lock-and-key per raffigurare la specificità delle reazioni enzimatiche, che sono una premessa molecolare della vita (4). L’enzima è stato considerato un modello rigido in cui il substrato doveva adattarsi come chiave in una serratura. Nel corso degli anni, tuttavia, è diventato evidente che un adattamento rigido tra strutture molecolari preformate non può spiegare tutti gli aspetti della catalisi enzimatica. Ad esempio, perché un substrato più piccolo non dovrebbe adattarsi al sito attivo di un enzima progettato per un substrato più grande? O perché alcuni enzimi sono altamente selettivi, ma altri possono ospitare diverse molecole di substrato strutturalmente diverse?
È in questo contesto che, oltre 40 anni fa, Daniel Koshland ha formulato il concetto di induced fit (7). Per facilitare la reazione enzimatica in assenza di un adattamento preciso, ha postulato che “il substrato può causare un cambiamento apprezzabile nella relazione tridimensionale degli amminoacidi nel sito attivo” (7). L’idea di un adattamento preciso è stata mantenuta dall’immagine lock-and-key, ma è stato affermato esplicitamente che l’adattamento “si verifica solo dopo le modifiche indotte dal substrato stesso” (enfasi originale). Il concetto divenne presto conoscenza da manuale e da allora è stato usato per spiegare tutti i tipi di processi di riconoscimento molecolare ben oltre le reazioni enzima-substrato. In effetti, l’analisi strutturale delle biomolecole interagenti ha stabilito più e più volte che un complesso e le sue molecole di componente libero possono differire nei dettagli fini della struttura, nell’apparente supporto del riconoscimento per adattamento indotto. Un buon esempio è fornito da diversi complessi antigene-anticorpo per i quali l’adattamento spaziale è stato dimostrato mediante analisi della struttura cristallina ad alta risoluzione (2). La plasticità strutturale è evidente anche in altre interazioni proteina-proteina (12).
Perché si dovrebbe mettere in discussione un concetto onorato dal tempo? La mia ragione è che il paragone di adattamento indotto spesso è troppo pronto a portata di mano per spiegare perché le molecole senza apparente complementarità strutturale interagiscono. Il problema sta nel presupposto originale che un adattamento favorevole si sviluppa solo dopo il legame iniziale, che viene spesso preso troppo alla lettera. Considerando la cinetica e la termodinamica di una reazione di legame, l’adattamento indotto è possibile solo se la corrispondenza tra i siti interagenti è abbastanza forte da fornire la forza e la longevità abbastanza complesse iniziali in modo che l’adattamento indotto avvenga entro un tempo ragionevole. Vorrei illustrare questo punto cruciale con un semplice calcolo del modello basato sul ciclo termodinamico mostrato in Fig. 1. Considerare le molecole A e B, che possono essere enzima e substrato, antigene e anticorpo, ormone e recettore o qualsiasi altra coppia di molecole interagenti. Per semplicità presumo anche che l’adattamento indotto si verifichi solo nella molecola B, che viene cambiata in B* per formare il complesso stabile AB*. (Questa ipotesi non influisce sul risultato del calcolo ma semplifica il formalismo matematico.) Il legame per adattamento indotto è descritto dalle reazioni 1 e 2 di Fig. 1. Nella reazione 1, A e B interagiscono per formare il complesso AB iniziale, che è una coppia di molecole liberamente legata. Interazioni precise ed energeticamente favorevoli si formano in seguito nella reazione 2, in cui B è costretto nella conformazione B* per adattamento indotto. L’energia per “tirare” e “spingere” di B nella conformazione del raccordo proviene dall’adattamento ottimizzato ottenuto nel complesso finale AB*. La costante di legame complessiva per il complesso AB * è K = K1 × K2 = k1 × k2/k-1 × k-2 (vedi Fig. 1 per le definizioni di costanti di legame e costanti di velocità cinetica).
FIGURA 1. Ciclo termodinamico per la reazione delle molecole A e B al complesso AB*, dove B e B * sono stati conformazionali diversi della stessa molecola. La via indotta-fit segue le reazioni 1 e 2. Il complesso iniziale AB formato nella reazione 1 non è stabile perché la conformazione di B non è ottimizzata. La reazione di adattamento indotta 2 porta B nella conformazione del raccordo B*. Il percorso di selezione conformazionale segue le reazioni 3 e 4. La reazione 3 descrive l’equilibrio conformazionale tra la conformazione non aderente B e la conformazione aderente B*. La reazione 4 è il legame della conformazione del raccordo B * ad A. La via indotta-fit è cineticamente competente solo se il complesso AB ha una stabilità apprezzabile in modo che l’adattamento indotto abbia una ragionevole possibilità di verificarsi. Se questo non è il caso e una piccola quantità della conformazione di raccordo B * è presente in assenza di A, il percorso di selezione conformazionale domina.
Come esempio pratico, immaginate un complesso antigene-anticorpo per il quale K è tipicamente dell’ordine di 108 M–1. Poiché la reazione 1 è sfavorevole, prendo K1 per essere 1 M–1, da cui ne consegue che K2 = 108 M-1. Poiché K2 >> K1, l’equilibrio è ben sul lato del complesso antigene-anticorpo AB*. Ad esempio, se l’anticorpo 1 × 10-6 M reagisce con l’antigene 1 × 10-6 M, l’equilibrio termodinamico è del 91% sul lato del complesso antigene-anticorpo (calcolato da K = 108 M–1 e totale = totale = 1 × 10-6 M, dove le parentesi quadre indicano la concentrazione). La domanda importante, che viene spesso trascurata, è quanto tempo ci vorrà per raggiungere questa concentrazione di equilibrio. Il corso del tempo è descritto da
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2 Per calcolare il tempo per raggiungere l’equilibrio, sono necessarie stime ragionevoli di k1 e k2 (k–1 e k–2 derivano dai valori scelti di K1 e K2; vedi Fig. 1). Il tasso di formazione di un complesso molto debole può essere ovunque tra 102 e 106 M–1•s–1. Scelgo k1 = 104 M•1 * s-1; tuttavia, il valore di k1 non ha molto effetto sul risultato del calcolo. I cambiamenti conformazionali nelle proteine hanno mezze volte di millisecondi, quindi scelgo k2 = 102 s–1 (metà tempo = 7 ms, da ln2/k2). I valori corrispondenti delle reazioni posteriori sono quindi k–1 = 104 s–1 e k–2 = 10-6 s–1. L’integrazione numerica delle equazioni 1 e 2 per le costanti di velocità di cui sopra e le concentrazioni iniziali di 1 × 10-6 M di antigene e anticorpo dà un mezzo tempo per la formazione del complesso antigene-anticorpo di ~2,5 h. Raggiungere così l’equilibrio richiede ~1 giorno (~10 mezze volte). La ragione di questo lungo tempo di reazione è che, una volta formato, il complesso antigene-anticorpo instabile AB ha solo una piccola possibilità di subire la transizione indotta fit al complesso antigene-anticorpo stabile AB*. L’adattamento indotto, sebbene termodinamicamente ragionevole, è troppo lento per essere significativo come reazione biologica.
La selezione conformazionale è un’alternativa all’adattamento indotto
Altri ricercatori, incluso me stesso (1, 3, 5, 8, 13, 14) hanno sottolineato che esiste un meccanismo alternativo all’adattamento indotto. L’essenza della selezione conformazionale, descritta dalle reazioni 3 e 4 di Fig. 1, è che il cambiamento di conformazione non si presume che si verifichi dopo il legame iniziale. Questa è un’ipotesi piuttosto ovvia. Prendi il complesso antigene-anticorpo AB*. Si dissocia in anticorpo libero A e antigene libero B * attraverso la reazione 4. Quindi B * si verifica in isolamento anche se può essere solo una conformazione minoritaria di breve durata, che si equilibra rapidamente con la conformazione principale B attraverso la reazione 3. Per calcolare quanto tempo ci vuole per raggiungere la concentrazione di equilibrio di AB * per selezione conformazionale, presumo che una molecola su mille sia in conformazione B* (K3 = 10-3). Ne consegue che K4 = 1011 M-1 dal ciclo termodinamico di Fig. 1 deve essere soddisfatto secondo K1 × K2 = K3 × K4 = K = 108 M-1. Presumo inoltre che il cambiamento conformazionale B → B* sia veloce quanto l’adattamento indotto (k2 = k3 = 100 s–1). Inoltre, è necessario un valore del tasso di associazione di B* con A nella reazione 4. Le costanti di velocità misurate per il legame antigene-anticorpo sono nell’intervallo 104-107 M-1 * s–1 (8, 9, 11). Scelgo un valore medio di k4 = 106 M•1 * s-1. In queste condizioni, la formazione del complesso antigene-anticorpo AB* attraverso le reazioni 3 e 4 ha un tempo di metà tempo di soli 80 s; la concentrazione di equilibrio di AB* è raggiunta in <15 min.
Questi calcoli dimostrano che il legame per adattamento indotto ha senso solo se esiste una certa misura di complementarità preesistente tra le specie interagenti; altrimenti il complesso iniziale AB è troppo breve (un’ipotesi implicita nel documento iniziale di Koshland). Utilizzando le costanti di forward rate k1 e k2 e le concentrazioni iniziali di 1 × 10-6 M, si scopre che K1 deve essere ~ 104 M-1 per raggiungere lo stesso tempo di 80 s per la via di adattamento indotta come per la via di selezione conformazionale.
Dimostrazione sperimentale del legame mediante selezione conformazionale
Sorprendentemente pochi studi hanno tentato di mostrare la selezione conformazionale nonostante il fatto che sia più facilmente dimostrata rispetto all’adattamento indotto (1, 5, 8, 15). Per dimostrare l’adattamento indotto, si dovrebbero campionare le informazioni strutturali nel corso della reazione di legame, un compito piuttosto difficile. Per dimostrare la selezione conformazionale, si deve dimostrare che il tasso di formazione del complesso AB* è linearmente proporzionale alla concentrazione del conformatore B* e non linearmente proporzionale alla concentrazione totale di B + B*. Se si può misurare la reazione di equilibrio conformazionale 3 in assenza del partner di legame A, si può calcolare la concentrazione di B* e prevedere la velocità complessiva di formazione di AB*.
Un esempio ben studiato è la reazione del frammento anticorpale a catena singola diretto contro il peptide contenente prolina lungo 33 residui GCN4-7P14P, chiamato peptide P in breve (6). Il peptide è molto simile in sequenza al dominio della chiusura lampo della leucina dell’attivatore trascrizionale GCN4 del lievito, salvo che non forma una chiusura lampo della leucina perché contiene due residui della prolina. (Le proline non sono compatibili con la conformazione elicoidale di una cerniera leucina, che è un dimero di eliche avvolte l’una intorno all’altra.) Tuttavia, l’anticorpo reagisce in modo incrociato con la cerniera leucina GCN4 e questa reazione incrociata segue chiaramente un percorso di selezione conformazionale. L’anticorpo reagisce con il peptide spiegato, che viene fornito dalla cerniera leucina piegata (reazione 3). Confrontando la reazione originale dell’anticorpo con il peptide P con la reazione incrociata con la cerniera leucina GCN4, ci si aspetta che la reazione incrociata sia più lenta poiché l’anticorpo deve selezionare una piccola quantità di peptide spiegato in equilibrio con una grande quantità di cerniera leucina piegata. Inoltre, la velocità della reazione incrociata con la cerniera leucina prevalentemente piegata mostrerà una dipendenza non lineare dalla concentrazione totale dell’antigene ma una dipendenza lineare dalla concentrazione della piccola quantità di peptide spiegato (8, 15). Questo non sarebbe il caso di un meccanismo di adattamento indotto, che dovrebbe essere bifasico, con la prima fase corrispondente a una reazione di associazione bimolecolare la cui velocità dipende linearmente dalla concentrazione totale dell’antigene e la seconda fase ad un riarrangiamento conformazionale indipendente dalla concentrazione. Figura 2 mostra i dati effettivi. Il tasso di formazione del complesso antigene-anticorpo dipende linearmente dalla concentrazione della piccola quantità di peptide spiegato e non linearmente dalla concentrazione di antigene totale (il fico. 2 BIS). La figura 2B mostra le tracce cinetiche della reazione più rapida con l’antigene originale e la reazione più lenta con la cerniera di leucina GCN4. Tuttavia, la selezione conformazionale della cerniera leucina dispiegata è ancora ordini di grandezza più veloce di una via indotta-fit perché legame dell’anticorpo alla cerniera leucina piegata (reazione 1 di Fig. 1) è estremamente debole (1).
FIGURA 2. Cinetica della reazione incrociata dell’anticorpo c11L34Ser con la cerniera leucina GCN4. A: la velocità della reazione incrociata con GCN4 è linearmente proporzionale alla concentrazione del peptide spiegato calcolato da K3 della reazione 3 in Fig. 1 ( ▪ ) e non lineare proporzionale alla concentrazione totale dell’antigene ( • ), come previsto per il percorso di selezione conformazionale. B: la velocità di reazione con il peptide originale è più veloce della velocità della reazione incrociata con GCN4 come previsto per il percorso di selezione conformazionale 3 → 4 in Fig. 1. Le tracce sono per la reazione di 4 × 10-7 M anticorpo con 4 × 10-6 M GCN4-7P14P (peptide P) e 4 × 10-6 M GCN4, rispettivamente. Dati adattati dal Ref. 1 con il permesso.
The energy landscape model of protein conformation
Le proteine piegate non hanno una singola struttura unica ma sono meglio considerate come un grande insieme di strutture simili con contenuti energetici simili. Questi cosiddetti conformatori sono in rapida fluttuazione l’uno con l’altro (10). Se il paesaggio energetico è liscio, i molti conformers si scambiano rapidamente. Se è robusto, l’insieme può includere conformers che possono essere molto diversi e interscambio più lentamente. Quindi la selezione tra le strutture B e B* è una vista grossolanamente semplificata. In realtà è più simile a una selezione tra molte strutture più o meno adatte (13). Tuttavia, il risultato finale della selezione conformazionale è lo stesso: quei conformer che mostrano la migliore vestibilità si legano meglio.
Conclusioni
La selezione conformazionale è una valida alternativa all’adattamento indotto. Questo non vuol dire che il legame per adattamento indotto non si verifica. In realtà, una combinazione di selezione conformazionale e adattamento indotto sembrerebbe essere la migliore descrizione dell’interazione tra molecole che apparentemente non si adattano in modo ottimale per cominciare. Possiamo immaginare una selezione tra strutture parzialmente adattate seguite da piccoli aggiustamenti al complesso stabile finale (che secondo la teoria del paesaggio è esso stesso un insieme di conformatori simili). Il punto principale è che l’adattamento indotto non può essere una cura, come spesso si pretende in letteratura. L’adattamento indotto richiede una corrispondenza molecolare precedente per fornire un’affinità sufficiente prima dell’adattamento conformazionale. Se questa condizione non è soddisfatta, l’adattamento indotto porta a un collo di bottiglia cinetico, anche se la reazione complessiva è termodinamicamente fattibile.
Sono grato a molti dei miei colleghi passati e presenti per discussioni utili e stimolanti.
Il lavoro del mio laboratorio è stato sostenuto in parte dalla Fondazione Nazionale svizzera della Scienza.
- 1 Berger C, Weber-Bornhauser S, Eggenberger J, Hanes J, Plückthun A e Bosshard HR. Riconoscimento dell’antigene mediante selezione conformazionale. FEBS Lett 450: 149-153, 1999.
Crossref | ISI | Google Scholar - 2 Davies DR e Cohen GH. Interazioni di antigeni proteici con anticorpi. Proc Natl Acad Sci Stati Uniti d’America 93: 7-12, 1996.
Crossref | ISI | Google Scholar - 3 Dürr E e Bosshard HR. Un anticorpo monoclonale induce l’apertura di una bobina arrotolata—la protezione globale dei protoni ammidici dallo scambio H/D diminuisce fino a 1000 volte nella bobina arrotolata a triplo filamento legata agli anticorpi. Eur J Biochem 249: 325-329, 1997.
Crossref / Google Scholar - 4 Fischer E. Einfluss der Configurazione auf die Wirkung der Enzima. Ber Dtsch Chem Ges 27: 2984-2993, 1894.
Google Scholar - 5 Foote J e Milstein C. Isomerismo conformazionale e la diversità degli anticorpi. Proc Natl Acad Sci USA 91: 10370-10374, 1994.
Crossref | ISI | Google Scholar - 6 Hanes J, Jermutus L, Weber-Bornhauser S, Bosshard HR e Plückthun A. Il display del ribosoma seleziona ed evolve in modo efficiente gli anticorpi ad alta affinità in vitro dalle librerie immunitarie. Proc Natl Acad Sci Stati Uniti d’America 95: 14130-14135, 1998.
Crossref / ISI / Google Scholar - 7 Koshland DE Jr. Applicazione di una teoria della specificità enzimatica alla sintesi proteica. Proc Natl Acad Sci Stati Uniti d’America 44: 98-104, 1958.
Crossref | ISI | Google Scholar - 8 Leder L, Berger C, Bornhauser S, Wendt H, Ackermann F, Jelesarov I e Bosshard HR. Dimostrazione spettroscopica, calorimetrica e cinetica dell’adattamento conformazionale nel riconoscimento peptide-anticorpo. Biochimica 34: 16509-16518, 1995.
Crossref | ISI | Google Scholar - 9 Mason DW e Williams AF. Cinetica delle reazioni anticorpali e analisi degli antigeni di superficie cellulare. In: Manuale di Immunologia Sperimentale (4 ° ed.), a cura di Weir DM, Herzenberg LA, Blackwell C, e Herzenberg LA. Oxford: Blackwell Scientific, 1986, p. 38.1–38.17.
Google Scholar - 10 Onuchic JN, Nymeyer H, Garcia AE, Chahine J, e Socci ND. The energy landscape theory of protein folding: insights into folding mechanisms and scenarios. Adv Protein Chem 53: 87-152, 2000.
Crossref | Google Scholar - 11 Raman CS, Jemmerson R, Nall BT, e Allen MJ. Tassi di diffusione limitati per il legame di anticorpi monoclonali al citocromo c. Biochimica 31: 10370-10379, 1992.
Crossref | ISI | Google Scholar - 12 Sundberg EJ e Mariuzza RA. Alloggi di lusso: il ruolo in espansione della plasticità strutturale nelle interazioni proteina-proteina. Struttura 8: R137-R142, 2000.
Crossref | ISI | Google Scholar - 13 Tsai CJ, Ma BY e Nussinov R. Folding and binding cascades: shifts in energy landscapes. Proc Natl Acad Sci USA 96: 9970-9972, 1999.
Crossref / ISI / Google Scholar - 14 Van Regenmortel MHV. Trascendere il paradigma strutturale in immunologia-affinità e attività biologica piuttosto che considerazioni puramente strutturali dovrebbe guidare la progettazione di epitopi peptidici sintetici. Biomed Pept Proteins Nucleic Acids 1: 109-116, 1995.
Google Scholar - 15 Zeder-Lutz G, Van Regenmortel MHV, Wenger R e Altschuh D. Interazione della ciclosporina A e di due analoghi della ciclosporina con la ciclofila: relazione tra struttura e legame. J Chromatogr B Biomed Appl 662: 301-306, 1994.
Crossref / ISI / Google Scholar