Super-preciso nuovo strumento CRISPR potrebbe affrontare una pletora di malattie genetiche

Per tutta la facilità con cui il popolarissimo strumento di editing genetico CRISPR–Cas9 altera i genomi, è ancora un po ‘ goffo e soggetto a errori ed effetti indesiderati. Ora, un’alternativa recentemente sviluppata offre un maggiore controllo sulle modifiche del genoma – un progresso che potrebbe essere particolarmente importante per lo sviluppo di terapie geniche.

Il metodo alternativo, chiamato prime editing, migliora le probabilità che i ricercatori finiscano con solo le modifiche che vogliono, invece di un mix di cambiamenti che non possono prevedere. Lo strumento, descritto in uno studio pubblicato il 21 ottobre su Nature1, riduce anche gli effetti “off-target” che sono una sfida chiave per alcune applicazioni del sistema standard CRISPR–Cas9. Ciò potrebbe rendere le terapie geniche basate su prime-editing più sicure per l’uso nelle persone.

Lo strumento sembra anche in grado di apportare una più ampia varietà di modifiche, che potrebbero un giorno permettergli di essere usato per trattare le molte malattie genetiche che hanno finora ostacolato gli editori di geni. David Liu, un biologo chimico presso il Broad Institute del MIT e Harvard a Cambridge, Massachusetts e autore principale dello studio, stima che il primo editing potrebbe aiutare i ricercatori ad affrontare quasi il 90% delle oltre 75.000 varianti di DNA associate alla malattia elencate in ClinVar, un database pubblico sviluppato dal National Institutes of Health degli Stati Uniti.

La specificità dei cambiamenti che questo ultimo strumento è in grado di potrebbe anche rendere più facile per i ricercatori di sviluppare modelli di malattia in laboratorio, o per studiare la funzione di geni specifici, dice Liu.

“Sono i primi giorni, ma i risultati iniziali sembrano fantastici”, dice Brittany Adamson, che studia la riparazione del DNA e la modifica del gene all’Università di Princeton nel New Jersey. “Vedrai molte persone che lo usano.”

La modifica primaria potrebbe non essere in grado di effettuare inserimenti o eliminazioni di DNA molto grandi di cui CRISPR–Cas9 è capace, quindi è improbabile che sostituisca completamente lo strumento di editing ben consolidato, afferma il biologo molecolare Erik Sontheimer presso la University of Massachusetts Medical School di Worcester. Questo perché per l’editing prime, il cambiamento che un ricercatore vuole fare è codificato su un filamento di RNA. Più a lungo quel filo diventa, più è probabile che sia danneggiato dagli enzimi nella cellula.

“Sono ancora necessari diversi tipi di piattaforme di modifica del genoma per diversi tipi di modifiche”, afferma Sontheimer.

Ma il primo editing sembra essere più preciso e versatile rispetto ad altre alternative CRISPR sviluppate finora. Quelli includono versioni modificate di CRISPR-Cas9 che consentono ai ricercatori di scambiare una lettera di DNA con un’altra e strumenti più vecchi come le nucleasi a dito di zinco, che sono difficili da adattare a ciascuna modifica desiderata.

Libertà attraverso il controllo

CRISPR–Cas9 e prime editing entrambi funzionano tagliando il DNA in un punto specifico del genoma. CRISPR-Cas9 rompe entrambi i filamenti della doppia elica del DNA e quindi si basa sul proprio sistema di riparazione della cellula per correggere il danno e apportare le modifiche. Ma quel sistema di riparazione è inaffidabile e può inserire o eliminare lettere di DNA nei punti in cui il genoma è stato tagliato. Questo può portare a una miscela incontrollabile di modifiche che variano tra le cellule.

Inoltre, anche quando i ricercatori includono un modello per guidare il modo in cui il genoma viene modificato, il sistema di riparazione del DNA nella maggior parte delle cellule è molto più probabile che faccia quei piccoli inserimenti o eliminazioni casuali piuttosto che aggiungere una sequenza di DNA specifica al genoma. Ciò rende difficile-e in alcuni casi quasi impossibile–per i ricercatori utilizzare CRISPR-Cas9 per sovrascrivere un pezzo di DNA con una sequenza di loro scelta.

La modifica primaria ignora questi problemi (vedere ‘Precision editor’). Sebbene usi anche Cas9 per riconoscere specifiche sequenze di DNA-proprio come CRISPR-Cas9 – l’enzima Cas9 nello strumento di modifica principale viene modificato per nick solo un filamento di DNA. Quindi, un secondo enzima chiamato trascrittasi inversa e guidato da un filamento di RNA, effettua le modifiche nel sito del taglio.

Il primo editing enzimi non devi rompere entrambi i filamenti di DNA di apportare modifiche, liberando i ricercatori basandosi sul DNA della cellula, sistema di riparazione — che non — per fare le modifiche che si desidera. Ciò significa che il primo editing potrebbe consentire lo sviluppo di trattamenti per malattie genetiche causate da mutazioni che non sono facilmente affrontate dagli strumenti di editing genico esistenti.

Uno strumento multiuso

In precedenza, i ricercatori, tra cui Liu, pensavano che avrebbero bisogno di sviluppare strumenti di editing genetico specifici per ogni categoria di cambiamento che volevano fare in un genoma: inserzioni, eliminazioni o sostituzioni di lettere di DNA. E le opzioni erano limitate quando si trattava di effettuare sostituzioni precise.

Una tecnica più vecchia, chiamata editing di base, che è paragonabile in precisione al primo editing, converte chimicamente una lettera di DNA direttamente in un’altra — qualcosa che CRISPR–Cas9 non può fare — come convertire una T in una A o una G in una C, senza rompere entrambi i fili di DNA 2. Sviluppato da Liu, l’editing di base potrebbe essere utile per correggere alcune malattie genetiche causate da mutazioni a lettera singola, inclusa la forma più comune di anemia falciforme.

Ma l’editing di base non può aiutare con i disturbi genetici causati da mutazioni multi-lettera come la malattia di Tay-Sachs, una malattia solitamente fatale tipicamente causata dall’inserimento di quattro lettere di DNA nel gene HEXA.

Così Liu ei suoi colleghi hanno deciso di creare un preciso strumento di gene-editing che ha dato ai ricercatori la flessibilità e il controllo per fare più tipi di modifiche senza dover creare sistemi su misura. Nel 2018, il team ha colpito il primo editing: una combinazione di enzimi, tra cui un enzima Cas9 modificato, che potrebbe cambiare singole lettere di DNA, eliminare lettere o inserire una serie di lettere in un genoma, con danni minimi ai filamenti di DNA.

“È fantastico”, dice Sontheimer. “L’ampiezza delle mutazioni che possono essere introdotte è uno dei più grandi progressi. E ‘ enorme.”

Ma il team di Liu e gli altri avranno ora bisogno di valutare attentamente quanto bene il sistema funziona in una varietà di cellule e organismi. ” Questo primo studio è solo l’inizio — piuttosto che la fine — di un’aspirazione di lunga data nelle scienze della vita per essere in grado di apportare qualsiasi cambiamento del DNA in qualsiasi posizione in un organismo”, afferma Liu.