august 4, 2021

Fordeler og begrensninger av microarray-teknologi i human cancer

i April i år opplevde vi en av de mest monumentale prestasjonene i biologi: den komplette sekvenseringen av det menneskelige genomet. Dekoding og database deponering av milliarder av baser av sekvensen er utgangspunktet for postsequence funksjonell genomikk. Oppdagelsen av Det Periodiske Bordet hadde en viktig innvirkning på kjemi. Så også, den komplette dekryptering av det menneskelige genomet vil ha imponerende effekter på menneskers helse og livskvalitet. For tiden forstår vi funksjonen til bare et begrenset antall menneskelige gener. Å studere alle menneskelige gener funksjon er en teknologisk utfordring. For å møte denne utfordringen, har nye high-throughput verktøy blitt utviklet. Microarray-analysen er en kraftig molekylær teknologi som tillater samtidig studie av uttrykket av tusenvis av gener eller DERES RNA-produkter, noe som gir et nøyaktig bilde av genuttrykk i cellen eller prøven på studietidspunktet.for eksempel kan uttrykket av alle gener for stoffresistens og metabolisme eller alle kjente onkogener i en celle detekteres og måles i samme tidsramme (Brown Og Botstein, 1999; Collins, 1999; Lander, 1999). Mikroarray kan defineres som en bestilt samling av mikrospotter (probene), hvert sted som inneholder en enkelt art av en nukleinsyre og representerer genene av interesse. Denne teknologien er basert på hybridisering mellom merkede frie mål avledet fra en biologisk prøve og en rekke MANGE DNA-prober som er immobilisert på en matrise (Southern et al ., 1999). Målene er produsert ved revers transkripsjon og samtidig merking AV RNA-ekstrakter fra en biologisk prøve hybridisert MED DNA-fragmentprober. Hybridiseringssignalet produsert på hver sonde er mRNA-uttrykksnivået for det tilsvarende genet i prøven på studietidspunktet. Signalene blir detektert, kvantifisert, integrert og normalisert med dedikert programvare og reflekterer ‘genekspresjonsprofilen ‘ eller’ molekylærportrett ‘ for hver biologisk prøve.Mange tusen eller titusenvis av forskjellige flekker kan skrives ut på en silisium-eller glassrute eller en nylon solid state-base. Det er hovedsakelig to varianter av mikroarrays: cDNA og oligonukleotid mikroarrays (Schena et al., 1995, 1996; Lockhart et al., 1996). Selv om begge typer microarray brukes til å analysere genuttrykk mønstre, disse variantene er fundamentalt forskjellige (Lipshutz et al., 1999). I cDNA-mikroarrays blir relativt lange DNA-molekyler immobilisert på en solid overflate. Denne typen mikroarray brukes mest til storskala screening og uttrykksstudier. Oligonukleotidmikroarray fremstilles ved in situ lysstyrt kjemisk syntese eller ved konvensjonell syntese etterfulgt av immobilisering på en glassmatrise. Denne mikroarrayen brukes til deteksjon av mutasjoner, genkartlegging og ekspresjonsstudier og muliggjør differensial deteksjon av genfamiliemedlemmer eller alternative transkripsjoner som ikke skiller seg fra cDNA-mikroarrays.mikroarrayets kjemi i seg selv er ikke ny, siden hybridiseringsteknologi har vært godt etablert i flere tiår. Den samtidige studien av tusenvis av gener forvandler imidlertid microarray-teknikken til et kraftig analyseverktøy for hele systemet. Nesten 10 år har gått siden de første mikroarrays ble opprettet, og likevel er denne teknologien fortsatt bedre og fremme. Siden den første introduksjonen har antall microarray-applikasjoner utvidet seg (Figur 1). Med utgangspunkt i deres bruk i gen-screening og målidentifikasjon, finner denne teknologien nye applikasjoner som utviklingsbiologi, sykdomsklassifisering, veistudier, narkotikaforskning og toksikologi. Teknologien som er involvert i produksjon og bruk av microarray er utenfor rammen av denne anmeldelsen, men har blitt grundig gjennomgått andre steder (Schena et al., 1995; Niemeyer og Blohm, 1999; Bowtell, 1999; Brown og Botstein, 1999; Celis et al., 2000; Jørgen et al., 1999; Duggan et al., 1999; Graves, 1999; Khan et al., 1999; Hegde et al.( 2000; Meldrum, 2000). Vi beskriver her noen av de siste utviklingene og resultatene i mikroarray-teknologi i kreftforskning, diskuterer potensielle problemer, beskriver kliniske applikasjoner og kommenterer fremtiden for denne teknologien.

betydningen av å måle global genuttrykk i humane kreftformer

Karakterisering av populasjonen av transkriberte gener har ført til etableringen av et nytt begrep, transkriptomet (Su et al., 2002). Dette konseptet definerer det komplette settet av transkriberte gener uttrykt som messenger Rna for en bestemt art. Transkriptomet representerer derfor universet AV rna-budbringere som kan kode for proteiner. Bare ca 5% av genene er aktive i en bestemt celle på et gitt tidspunkt. De fleste genene er undertrykt, og denne kontrollen kan forekomme på enten transkripsjonelt eller translasjonelt nivå. Siden reguleringen av proteinuttrykk på transkripsjonsnivået er mer effektiv, foregår mest kontroll på dette nivået. Genuttrykksprofilen til en celle bestemmer dens funksjon, fenotype og respons på ytre stimuli. Derfor kan genuttrykksprofiler bidra til å belyse cellulære funksjoner, biokjemiske veier og regulatoriske mekanismer. I tillegg kan genuttrykksprofiler av sykdomsceller/vev, sammenlignet med normale kontroller, fremme forståelsen av sykdomspatologi og identifisere nye terapeutiske intervensjonspunkter, forbedre diagnose og klargjøre prognose.

i løpet av de siste årene har flere genuttrykk profilering metoder dukket opp og har blitt brukt med hell til kreftforskning. Disse inkluderer differensialvisning, seriell analyse av genuttrykk og mikroarrays (Velculescu et al., 1995; Granjeaud et al., 1999; Cheng et al., 2002). Mikroarrays har blitt viktige fordi de er enklere å bruke, krever ikke STORSKALA DNA-sekvensering og tillater parallell kvantifisering av tusenvis av gener fra flere prøver. Genuttrykk profilering av kreft representerer den største kategorien av forskning ved hjelp av microarray teknologi og synes å være den mest omfattende tilnærmingen til å karakterisere kreft molekylært. Selv om kreftfenotypen bare delvis bestemmes av dens transkriptom, gir den fortsatt et klart bilde av en celles fysiologiske tilstand. Kraften i denne tilnærmingen har blitt demonstrert i studier utført på et omfattende utvalg av maligniteter, inkludert kreft i bryst, hode og nakke, lever, lunge, eggstokk, bukspyttkjertel, prostata og mage (Bhattacharjee et al., 2001; Dhanasekaran et al., 2001; Garber et al., 2001; Tonin et al., 2001; Al Moustafa et al., 2002; Belbin et al., 2002; Chen et al., 2002; Han et al., 2002; Hedenfalk et al., 2002; Flodhest et al., 2002; Luo et al.( 2002a).

Flere studier av kreftprofilering ved mikroarrayanalyse har brukt forskjellige strategier som tumor versus kontroll, hvor tumorgenuttrykksprofilen sammenlignes med tilhørende kontrollprøve for å måle forskjellene og likhetene mellom begge fenotyper, kreftlagring, hvor genuttrykksprofilene fra forskjellige prøver av samme krefttype sammenlignes for å avsløre distinkte undergrupper for bedre å definere molekylær klassifisering av en felles histologisk type kreft, og til slutt temporal evaluering av svulsten, hvor genet har en felles histologisk type kreft. uttrykksmønstre fra tumorprøver avledet fra ulike stadier av progresjon blir sammenlignet for å belyse forskjellene mellom de tidlige og avanserte stadier av sykdommen. Selv om mange studier av microarray analyse i human disease har blitt publisert, presenterer vi her noen av de som har en klinisk interesse for onkologi.

Mikroarray og prostatakreft

Flere studier som bruker mikroarrays for å karakterisere prostata kreft genuttrykk profiler har nylig blitt publisert. Disse studiene har brukt microarray-teknologi som et genoppdagelsesverktøy for å identifisere genetiske markører som diskriminerer mellom normalt og kreftformet prostatavev. En enkel mikroarray-studie har blitt utført ved bruk av spotted membranarrays for å analysere normale og kreftvev og cellelinjer (Bull et al., 2001). Membranmikroarray funn er begrenset av den relative ufølsomheten til denne teknikken for å oppdage transkripsjoner uttrykt ved lave nivåer og det lille antallet flekker som kan plasseres på membranene; denne studien har imidlertid gitt kandidatmarkører av prostatakreft for videre evaluering. Fem publiserte studier har analysert genuttrykksprofiler i flere tusen gener i normalt og prostatavev og brukt uovervåket hierarkisk klyngeanalyse for å sortere prøver (Dhanasekaran et al., 2001; Luo et al., 2001, 2002b; Welsh et al., 2001a; Singh et al., 2002). Dhanasekaran et al. (2001) var i stand til å skille mellom normal prostata, godartet prostatahyperplasi( BPH), lokalisert prostatakreft og metastatisk prostatakreft prøver ved hjelp av 9,984 element-spotted microarrays. Ved hjelp av hierarkisk clustering analyse, Luo et al. (2001) var i stand til å diskriminere 16 prostatakreftprøver fra ni bph-prøver på grunnlag av forskjeller i genuttrykksprofiler målt på 6500 element-spotted cDNA-mikroarrays. Welsh et al. (2001a) rapporterte en lignende sortering av normale og ondartede prostatavevsprøver ved bruk av oligonukleotidmikroarrays. Interessant, alle de fem gruppene identifisert transmembrane serin protease hepsin som viser betydelig økt uttrykk i ondartet vev sammenlignet med normal prostatavev (Dhanasekaran et al., 2001; Luo et al., 2001, 2002b; Welsh et al., 2001a; Singh et al., 2002). Mange andre kandidatmarkører av prostatakreft som proto-onkogen PIM1 har kommet fra andre studier og blir videre undersøkt som potensielle diagnostiske markører. Det reduserte PIM1-uttrykket på immunhistokjemi av prostatatumorprøver ga økt risiko for tilbakefall etter operasjon (Dhanasekaran et al., 2001). Andre grupper som bruker kombinasjoner av subtraktiv hybridisering og mikroarray analyse har identifisert flere potensielle kandidater for prostatakreft immunmodulerende terapi inkludert prostein (Xu et al ., 2001), STEAP (Hubert Et al. 1999) og P504s / Alfa-Metylacyl-Coa-Racemase (Jiang et al., 2001). I en meget nylig studie, Virolle et al. (2003) brukte en prostatakreftcellelinje som uttrykker et høyt konstitutivt nivå Av Egr1-protein, en transkripsjonsfaktor overuttrykt i flertallet av aggressive tumorigeniske prostatakreftceller. De vurderte egr1 transkripsjonell regulering, ved å utføre en oligonukleotid mikroarray analyse ved hjelp av celler gjengitt mangelfull I Egr1 som sammenligningsprøve for identifisering Av Egr1 målgener. For første gang i prostatavev bekreftet denne studien vekstforsterkerrollen Til Egr1 som tidligere ble observert i andre cellulære systemer, og identifiserte flere nye målgener som spesifikt kontrollerte vekst, cellesyklusprogresjon og apoptotiske veier.

Mikroarray og oral kreft

Hittil har bare noen få mikroarray studier som er relevante for oral kreft blitt publisert. Chang et al. (1998) illustrert bruken av cDNA-mikroarrays for å karakterisere transformasjonsrelaterte gener i oral kreft. Villaret et al. brukt en kombinasjon av komplementær DNA-subtraksjon og mikroarray-analyse for å evaluere unike gener som er spesifikke for plateepitelkarsinom i hode og nakke (HNSCC) som potensielle tumormarkører og vaksinekandidater. Ni kjente gener ble funnet å være signifikant overuttrykt I HNSCC sammenlignet med normalt vev. I tillegg ble fire nye gener overuttrykt i en delmengde av svulster (Villaret et al., 2000). Alevizos et al. (2001) analyserte transkriptomet i plateepitelkarsinom i munnhulen. De fant omtrent 600 kandidatgener (onkogener, tumor suppressorer, transkripsjonsfaktorer, differensieringsmarkører, metastatiske proteiner og xenobiotiske enzymer) som ble differensielt uttrykt i oral kreft, og validerte bare tre av disse genene VED PCR.

Lu et al. (2001) brukte microarray-tilnærmingen til å evaluere genuttrykksprofilendringer under initiering og progresjon av squamouscellekarsinom i spiserøret. De undersøkte genuttrykk profiler i ulike stadier av initiering og progresjon av esophageal kreft for å identifisere gener differensielt uttrykt mellom disse stadiene. Frierson et al. (2002) brukte oligonukleotid microarray analyse for å studere uttrykket av 8,920 forskjellige humane gener i 15 adenoid cystisk karsinomer (Acc), EN ACC cellelinje og fem normale store spyttkjertler. Blant gener med endret uttrykk i ACC var de som koder for transkripsjonsfaktorene SOX4 og AP-2 gamma, kaseinkinase 1 samt epsilon og frizzled-7, som begge er medlemmer Av wnt / beta-catenin signalveien. I en meget nylig studie, Leethanakul et al. (2003) genererte cDNA-biblioteker med høy kompleksitet fra laserfangst mikrodissisert normalt og kreftformet plateepitel. I denne studien undersøkte forfatterne tilgjengelig sekvensinformasjon ved hjelp av bioinformatiske verktøy og identifiserte 168 nye gener differensielt uttrykt i normalt og ondartet epitel. Videre, ved hjelp av cDNA-arrays, oppnådde de bevis på at en delmengde av disse nye gener kan være sterkt uttrykt i HNSCC.

Mikroarray og brystkreft

Gitt den kliniske heterogeniteten av brystkreft, kan mikroarray-teknologi være et ideelt instrument for å etablere en mer nøyaktig klassifisering. Innledende studier ved hjelp av microarray-baserte uttrykk profilering demonstrert sin evne til å korrekt klassifisere østrogen reseptor-negative og østrogen reseptor-positive brystkreft (Perou et al., 2000; Vest et al., 2001) og å skille BRCA1-relaterte svulster FRA BRCA2-relaterte og sporadiske svulster (Hedenfalk et al., 2001; van ‘ t Veer et al., 2002).

studien av van ‘ t Veer et al. har vært en av de mest omfattende og informative studier utført hittil. Forfatterne undersøkte 117 primære brystprøver ved mikroarray-basert genuttrykksprofilering for å utvikle prognostiske profiler og sammenligne disse med kjente prognostiske markører i brystkreft. Av de 5000 genene med variable uttrykksprofiler ble 70 identifisert for optimal nøyaktighet ved å forutsi tilbakevendende sykdom. Ved hjelp av denne klassifiseringen forutslo forfatterne riktig det faktiske utfallet av sykdom for 65 av de 78 pasientene. Fem pasienter med god prognose og åtte pasienter med dårlig prognose ble feilaktig tildelt. Standard prognostiske markører for brystkreft ble brukt til å estimere risikoen for tilbakefall av kreft og bidra til å ta beslutninger om adjuvant behandling. Dessverre identifiserer nåværende prognostiske markører ikke tilstrekkelig den mest korrekte behandlingen for pasienten. Den prediktive kraften til microarray-tilnærmingen er mye større enn den for tiden brukte tilnærminger, men den må valideres i flere prospektive kliniske studier. Hvis prognostisk verdi av denne tilnærmingen ble bekreftet, ville ekspresjonsprofileringsklassifiseringen resultere i omtrent en firedobling hos pasienter som får adjuvant behandling unødvendig (Caldas og Aparicio, 2002).

Martin et al. (2001) beskrev en metode for å identifisere sirkulerende brystkreft ved en to-trinns prosess med differensialvisning og høysensitiv array-basert uttrykksprofilering. Selv om potensialet i denne teknikken er lovende, dens følsomhet og spesifisitet fortsatt må forbedres og mer arbeid er nødvendig for å bestemme den kliniske betydningen av genuttrykk profil deteksjon i perifert blod. Noen artikler har nå vist en sammenheng mellom tumoruttrykksprofiler ved hjelp av microarray-teknologi og klinisk utfall. For eksempel, Sorlie et al. (2001) viste at tumorunderklasser definert ved uttrykksprofilering kan forutsi sykdomsfri og total overlevelse, Og Sotiriou et al. (2002) viste at forbehandlingsuttrykksprofiler forutslo klinisk respons på kjemoterapi i en liten prøve av brysttumorer. Selv om studiet Av Sorlie et al. forfatterne sammenlignet ikke prognostisk verdi av gruppene identifisert ved hierarkisk clustering med for tiden brukte prognostiske faktorer i brystkreft. Siden medikamentresistens i kreft er et stort hinder for vellykket kjemoterapi, er muligheten for å oppnå en potensiell molekylær profil eller fingeravtrykk av kreftmedikamenter i kreftceller ved microarray-teknologi kritisk for å forutsi kjemoterapirespons. Kudoh et al. (2000) viste denne evnen til å definere endringer i genuttrykksprofiler i en brystkreftcellelinje behandlet med kjemoterapi. De overvåket uttrykksprofilene TIL MCF-7 brystkreftceller som enten ble forbigående behandlet med doksorubicin eller valgt for resistens mot doksorubicin. Denne studien viste at forbigående behandling med doksorubicin endret uttrykket av en mangfoldig gruppe gener på en tidsavhengig måte.

Mikroarray og eggstokkreft

i løpet av de siste årene har flere forskere publisert interessante studier om uttrykksprofilering av eggstokkreft. Martoglio et al. (2000) analyserte genuttrykksprofilene til fem normale eggstokkene og fire dårlig differensierte serøse papillære ovarieadenokarsinomprøver. Ved å bruke en liten ‘in-house’ nylonmembran cDNA microarray, fant de en samlet økning i angiogeneserelaterte markører (f.eks. angiopoietin-1, VEGF), apoptotiske og neoplastiske markører, immunresponsmediatorer og nye potensielle markører for eggstokkreft (f. eks. kofilin, moesin og nevronbegrensende lyddemperfaktorprotein) i kreftvevet. Studien var spennende fordi de brukte en billig cDNA-array skreddersydd for studier av spesifikke veier, som angiogenese og tumorigenese. Siden det er problematisk å få tilgang til en tilstrekkelig mengde tidlig eggstokkumorvev, brukte forskerne forskjellige strategier for å omgå behovet for vevsmengder som vanligvis kreves ved mikroarray-analyse. For eksempel, Ismail et al. (2000) rapporterte en studie av 864 DNA-elementer som ble screenet mot 10 eggstokkreftcellelinjer og fem normale epitelcellelinjer ved bruk av kortvarig cellekultur for å utvide ovarieoverflateepitelet før RNA-ekstraksjon. Andre etterforskere renset ovarieepitel ved in vitro prosedyrer, slik som tilslutning til glass eller immunomagnetisk berikelse (Ono et al., 2000; Welsh et al.( 2001b). Imidlertid kan disse to tilnærmingene introdusere forstyrrelser i observert genuttrykk. Faktisk, den første tilnærmingen (Ismail et al., 2000) bruker dyrkede kreftceller, som kanskje ikke reflekterer in vivo kreft på grunn av muligheten for sekundære genuttrykksendringer som forekommer in vitro som følge av kulturforhold. Den andre strategien (Ono et al., 2000; Welsh et al., 2001b) er svært lang og kan føre til nedbrytning av mindre stabile RNA-budbringere. For å unngå mulige skjevheter som ligger i in vitro kulturer som brukes i noen studier (Ismail et al., 2000; Matei et al., 2002), har andre etterforskere studert genuttrykk mønstre direkte fra kirurgisk resected svulster (Shridhar et al., 2001). Små, spesialiserte mikroarrays har flere praktiske fordeler og kan avsløre informasjon som kan gå tapt i større mikroarrays. Sawiris et al. (2002) brukte en høyt spesialisert cDNA mikroarray kalt ‘Ovachip’, og fant denne mikroarrayen ekstremt følsom ved å skille eggstokkreft fra kolonkreft basert på genuttrykksmønstre. Screening biomarkører for eggstokkreft er svært viktig på grunn av sent stadium ved diagnose og dårlig overlevelse forbundet med denne typen kreft. Nylig brukte to studier microarray-teknologi for å identifisere to overuttrykkede potensielle eggstokkreft serummarkører kalt osteopontin og prostasin, og rapporterte foreløpig validering av deres bruk for tidlig påvisning av sykdommen (Mok et al., 2001; Kim et al., 2002).

Microarray og andre kreftformer

anvendelsen av microarray-teknologi til andre humane kreftformer vokser raskt. Den banebrytende studie Av Golub et al. (1999) demonstrerte muligheten for å skille mellom akutt myelogen leukemi og akutt lymfoblastisk leukemi (ALL) basert på genuttrykksovervåking og hvordan de to klassene i en simulert situasjon ‘blindet’ til den histologiske diagnosen kunne ha blitt oppdaget av genuttrykksmønstrene alene. Alizadeh et al. (2000) identifiserte de to former for diffus stort b-cellelymfom (DLBCL) på grunnlag av genuttrykksprofiler som er indikative for forskjellige stadier Av b-celledifferensiering. Interessant nok har denne molekylære klassifiseringen prognostisk verdi uavhengig av stratifisering ved vanlig klinisk gradering. For å studere genuttrykk i lymfoide maligniteter, opprettet en stor samarbeidsgruppe en spesialisert mikroarray, Kalt ‘Lymphochip’, som er beriket i gener som selektivt uttrykkes i lymfocytter og i gener som regulerer lymfocyttfunksjonen (Alizadeh et al ., 1999). Denne gruppen brukte denne mikroarrayen til å undersøke DLBCL og fant to molekylært forskjellige former for denne svulsten. VIDERE viste DE at DLBCL-undergruppene definerte en undergruppe av pasienter med en distinkt klinisk prognose. For å teste hypotesen om at b-celle kronisk lymfatisk leukemi (KLL) er mer enn en sykdom, Rosenwald et al. (2001) relatert genuttrykksmønstre AV KLL til Deres ig mutasjonsstatus og til andre typer normale Og ondartede B-celler. Interessant nok ble genene identifisert som sterkt uttrykt I KLL sammenlignet MED DLBCL uttrykt ekvivalent i alle kll-prøver uavhengig av deres ig-mutasjonsstatus. Denne studien foreslo at ALLE KLL-tilfeller delte en felles transformasjonsmekanisme og / eller opprinnelsescelle. En nylig studie (Stratowa et al., 2001) har foreslått en liste over potensielle nye prognostiske markører involvert i lymfocytthandel og assosiert med sykdomsstaging og / eller pasientoverlevelse.

I en veldig nylig studie, Gariboldi et al. (2003) analyserte genuttrykksprofilene i det normale vevet av hudtumorfølsomme og resistente mus for å identifisere gener som spiller en funksjonell rolle i genetisk følsomhet. Denne studien har antydet En Rolle Av Scca2-genet, et medlem av serinproteasehemmeren superfamily, i den genetiske predisposisjonen til hudtumorer.Mikroarray-teknologi har også blitt brukt til å analysere melanom (Bittner et al., 2000). Denne studien foreslo at genuttrykksprofiler i en individuell pasients vev kan bli bemerkelsesverdig bevart over tid, og at global transkriptanalyse kan identifisere ukjente subtyper av kutant melanom og forutsi eksperimentelt verifiserbare fenotypiske egenskaper.Studier på kolonkreftceller og vev viste signifikant undertrykkelse Av kinasegenet, WEE1Hu (Backert et al., 1999).

Mange transkriptomer endres etter spesifikk overuttrykk av tumorrelaterte gener. For eksempel har vi benyttet et adenovirus-mediert uttrykkssystem AV rb2 / p130 tumor-suppressorgen i en ikke-liten lungekreftcellelinje for å identifisere spesifikke gener som er regulert av pRb2 / p130 (Russo et al ., 2003). Våre microarray-resultater har identifisert en rekke gener involvert i mange cellulære prosesser, inkludert celledeling, cellesignalering/cellekommunikasjon, cellestruktur/motilitet og genuttrykk og metabolisme. Disse resultatene tyder på nye potensielle terapeutiske biomarkører i lungekarsinom. Videre viser resultatene fra en annen cDNA microarray-studie at overuttrykket av tumor-suppressorgenet PTEN kan hemme lungekreftinvasjon ved å nedregulere et panel av gener (Hong et al., 2000). I lys av de ovennevnte dataene er det klart at mikroarray-tilnærmingen er svært viktig i analysen av en rekke svulstyper.