juli 6, 2021

Litiumklorid dreper effektivt honningbie parasitten Varroa destructor ved en systemisk virkemåte

Pilotstudie: Fra RNAi til litiumklorid

i en pilotstudie, midd-infisert honningbier ble bur og matet sukrose sirup som inneholder dsrna av potensielt essensielle varroa gener (Supplerende Tabell S1). Vanlig sukrosesirup (ubehandlet) og sirup med dsRNA basert på kodingssekvensen for det grønne fluorescerende proteinet GFP (dsGFP ctrl) fungerte som kontroller. GFP uttrykkes i den bioluminescerende hydrozoan maneter Aequorea victoria. Gfp-sekvensen ble valgt som en kontroll fordi det ikke finnes noe homologt gen i genomet av honningbier eller Varroa-myten. I ubehandlet gruppe midd dødelighet var < 5%. I motsetning til dette ble alle kvaler på bier som mottok sukroseoppløsning som inneholdt dsRNA rettet Mot varroa-gener, effektivt drept innen tre dager. En identisk effekt på kvaler ble imidlertid observert i et kontrollforsøk hvor bier ble matet GFP dsRNA(Supplerende Fig. S1). Disse resultatene utelukket den foreslåtte rnai-medierte mekanismen, men foreslo enten en ennå ukjent effekt AV RNA eller aktiviteten til andre komponenter i testløsningen. Da høye konsentrasjoner av litiumklorid (LiCl) ble brukt i produksjonen av dsrna og derfor matet til biene sammen med dsRNA, valgte vi å mate LiCl i sukroseoppløsning til burbier for å teste sin aktivitet mot Varroa-myter. Påfallende Drepte LiCl i konsentrasjoner på 25 mM, som tilsvarer den beregnede konsentrasjonen i dsrna-løsningen, kvalene så effektivt som teststoffene som inneholder dsRNA. Videre, Etter LiCl ble i stor grad fjernet fra dsRNA ved omfattende vask (vasket dsGFP ctrl), miticidal aktivitet ble betydelig redusert som indikert ved forsinket debut og redusert aktivitet (Supplerende Fig. S1). Fra disse dataene konkluderte Vi med At LiCl, ikke RNA knockdown, medierte den observerte aktiviteten på Varroa-myter, og at det ville være verdt å analysere Potensialet For LiCl som varroacid.

Effektiv konsentrasjon av litiumklorid

for å bekrefte de primære observasjonene i vår pilotstudie etablerte vi burforsøk med forskjellige konsentrasjoner Av LiCl for robust statistisk analyse. I tillegg til 25 mM-konsentrasjonen, som ble funnet å være effektiv i pilotstudien, brukte vi konsentrasjoner på 2 mM, 4 mM og 10 mM for å bestemme den nedre terskelen for effekt. Resultatene støttet funnene fra den forrige studien og viste signifikante miticidale effekter for LiCl-konsentrasjoner så lave som 2 mM hvor en betydelig økning i midd dødelighet (P < 0,001, Log-rank test; Supplerende Tabell S2) ble vist. Høyere konsentrasjoner på 10 mM og 25 mM både signifikant forbedret midd dødelighet starter på dag to av behandlingen og oppnådd utryddelse av mer enn 96% av de behandlede midd på slutten av forsøket (Fig. 1a, Supplerende Tabell S2). I kontrollforsøkene uten LiCl i mateløsningen nådde midd dødelighet i gjennomsnitt 9,3% og var derfor godt innenfor området for dødelighet oppnådd for midd holdt på ubehandlede burbier under forskjellige miljøforhold33. Basert på disse resultatene, bekreftet Vi En klar effekt Av LiCl på midd levedyktighet i et konsentrasjonsområde mellom 2 mM og 25 mM.

i disse forsøkene ble de burede biene matet med Den respektive Konsentrasjonen Av LiCl over flere dager til alle kvalene ble drept av behandlingen. For potensiell bruk i biavlspraksis vil imidlertid en kortere og definert behandlingsperiode være å foretrekke. Vi utførte derfor et ekstra eksperiment, der den mest effektive konsentrasjonen av 25 mM LiCl (Fig. 1a) ble administrert i 24 timer etterfulgt av tilførsel med sukkeroppløsning i ytterligere seks dager. På slutten av observasjonsperioden, 92.9% av midd (n = 225 midd, P < 0.001, log-rank test) ble drept uten noen signifikant effekt på de behandlede bier (se neste avsnitt). Dette resultatet viser tydelig at selv en kortvarig tilførsel av 25 mM LiCl er tilstrekkelig til å redusere mykpopulasjonen betydelig.

for å nøyaktig bestemme den inntatte Mengden LiCl av biene som er nødvendig for å drepe parasitterende midd, ble 12 nyklekkede bier kunstig matet 10 µ Av LiCl-løsninger på 4 mM til 100 mM og holdt individuelt med en phoretic mite i fem dager i bur. Med 4 mM-og 10 mM-oppløsningene, som tilsvarte et opptak på henholdsvis 1,7 µg og 4,2 µ LiCl, var effekten ikke signifikant forskjellig fra ubehandlet kontroll (n = 12 midd, P = 1.000, log-rank test, Supplerende Tabell S3). Imidlertid var en enkeltdose på 25 mM, tilsvarende 10,6 µ LiCl konsumert av biet, tilstrekkelig til å drepe 100% av de phoretic mites innen 48 timer (Fig . 2).

Effekt på arbeiderbier

For analyse Av toleransen Av LiCl til arbeiderbier, ble testburene som ble brukt til å analysere midd dødelighet (Fig. 1a) ble i tillegg registrert for dødeligheten av arbeiderbiene. Etter eksponering for 2 mM, 10 mM Og 25 mM LiCl som har vist seg å utøve miticidal aktivitet, varierte den behandlede arbeiderbiedødeligheten i gjennomsnitt fra 3 til 7% innenfor de forskjellige mategruppene. Med unntak av 10 mM LiCl-gruppen (n = 12 merder, P = 0,015, Log-rank test; Supplerende Tabell S4) var verdiene ikke signifikant forskjellig fra 4% dødelighet i ubehandlet kontrollgruppe. Videre var dødeligheten av våre kontroller godt innenfor området for dødeligheten av ikke-behandlede burbier som kreves som en kontroll i toksikologiske tester34, og bekrefter derfor gyldigheten av vårt testsystem. Også 24 h-behandlingen med LiCl påvirket ikke dødeligheten av arbeiderbier(Fig . 1b; n = 9 bur, P = 0,308, log-rank test). En god toleranse For LiCl til bier ble også bekreftet ved tilførsel av en enkelt dose (For mite dødelighet se Fig. 2) som ikke fremkalte en signifikant økning i arbeiderbiedødelighet (P = 1.000, log-rank test; Supplerende Tabell S5).

deretter ble Ulike Konsentrasjoner Av LiCl kontinuerlig matet til den siste burbi døde for å undersøke respons på langvarig eksponering. Her reduserte behandlingen signifikant gjennomsnittlig levetid for nyklekte arbeiderbier fra 26 dager i de ubehandlede kontrollburene til 23 og 22 dager for henholdsvis 2 mM og 10 mM LiCl (n = 60 bier, P = 0,024, Log-rank test; Supplerende Tabell S6). I bier som fikk den høyeste konsentrasjonen av 25 mM LiCl levetiden ble betydelig redusert til 19 dager i gjennomsnitt (Fig. 3a).

Imidlertid Ser LiCl ut til å hindre bienes levedyktighet bare hvis det administreres over en lengre periode som angitt av et ekstra eksperiment der LiCl ble matet for de første 24 timene etter klekking og ble deretter erstattet av sukrosesirup til den siste burbi døde (Fig . 3b). Her varierte gjennomsnittlig levetid for nyklekkede arbeiderbier fra 22 dager (10 mM) til 24 dager (kontroll) uten signifikante forskjeller mellom behandlingene (n = 120 bier per behandling, p ≥ 0,126, log-rank test; Supplerende Tabell S7). Basert på disse dataene fra burbier, konkluderer vi med at selv en kortvarig LiCl-behandling er tilstrekkelig til å fullstendig utrydde Varroa-mite-angrep med liten eller ingen innvirkning på levedyktigheten til arbeiderbier. Disse resultatene oppnådd i merdtester under kontrollerte forhold representerer et vellykket og lovende første skritt mot en ny tilnærming til Varroa-behandling. Imidlertid må effektivitet og bivirkninger bekreftes under feltforhold.

felttester med litiumklorid i kunstige svermer

til omtrentlige feltforhold testet vi 25 mM Og 50 mM LiCl i ni stamfrie kunstige svermer bestående av en dronning og ca 20.000 bier hver. Disse konsentrasjonene ble valgt ut fra tidligere eksperimenter med burbier ved bruk av den høyeste dosen som fortsatt ble tolerert av bier i korte påføringstider (25 mM). Fordi en jevn fordeling av sukrosesirup gjennom hele den kunstige sværmen på ca 20.000 bier kan ha vært vanskelig å oppnå, testet vi i tillegg en 50 mM Konsentrasjon Av LiCl for å sikre at hver bi ble utsatt for tilstrekkelige mengder litium. Følgelig ble svermene matet ad libitum med sukrosesirup inneholdende 25 mM LiCl (n = 6) eller 50 mM (n = 3) i en periode på tre dager, etterfulgt av en topisk påføring Av Perizin®. Perizin® som inneholder organofosfat coumafos som aktiv ingrediens, er et svært effektivt varroacid som vanligvis brukes som kontrollbehandling35. Midd dødelighet ble overvåket over en periode på fem dager. Før kontrollbehandlingen drepte 25 Mm LiCl ca. 90% av middene som var tilstede i de kunstige svermene (Tabell 1). Den høyere konsentrerte oppløsningen (50 mM) økte imidlertid ikke denne effekten (χ 2 test, P = 0,953). Samlet sett var effekten noe lavere sammenlignet med merdtestene. En forklaring kan være at fordelingen Av LiCl i en klynge av tusenvis av bier krever mer tid til den siste individuelle bi bruker en tilstrekkelig dose for å drepe den respektive parasitterende mite. Den nødvendige matetiden til slike store enheter av 20.000 bier og mer må analyseres i videre eksperimenter.

Tabell 1 Sammenligning av varroacidvirkningen av to litiumkloriddietter administrert til kunstige svermer i fem dager.

Effekt av andre litiumforbindelser og ikke-litiumsalter

for å bekrefte litium som den aktive komponenten for effekten På varroa-myter, testet vi en serie litiumforbindelser og sammenlignet miticidale effekter med ikke-litiumsalter. Av spesiell interesse var litiumsitrat, en forbindelse med tre litiumioner, litiumsulfat og litiumkarbonat, som har to litiumioner sammenlignet med Bare en litiumion i LiCl. Ytterligere forbindelser med ett litiumion (litiumlaktat, litiumacetat), men forskjellig oppløselighet, kjemisk reaktivitet og pris ble inkludert for å analysere effekt og toleranse sammenlignet Med LiCl. I burforsøk eliminerte alle forbindelser 100% av midd ved 25 mM innen tre (litiumsitrat og litiumacetat) til fire dager (litiumsulfat, litiumlaktat og litiumkarbonat). Også 4 mM testløsninger, helt drept phoretic midd innen fem (litiumsitrat, litiumsulfat, og litiumacetat) til syv dager (litiumlaktat) unntatt litiumkarbonat (Tabell 2; Supplerende Tabell S8).

Tabell 2 Dødelighet av phoretic Varroa midd og arbeiderbier etter å ha matet to konsentrasjoner av forskjellige litiumforbindelser over en maksimal mateperiode på syv dager.

dødeligheten av arbeiderbier økte ikke signifikant ved noen av konsentrasjonene sammenlignet med ubehandlede kontrollbier, bortsett fra 25 mM litiumsulfat og 25 mM litiumlaktat (Supplerende Tabell S9). Med disse forsøkene kunne vi bekrefte at andre litiumforbindelser har et lignende potensial for bruk som et systemisk akaricid. Dette kan øke fleksibiliteten for mulig utforming av et veterinærprodukt. Med tanke på prisen er litiumklorid og litiumcitrat de billigste forbindelsene. Litiumsulfat er mindre egnet på grunn av lavere bee toleranse og litiumkarbonat på grunn av en relativt lav vannløselighet.For å undersøke den konsentrasjonsavhengige effekten av litiumforbindelser mer detaljert, sammenlignet Vi LiCl med litiumcitrat (Li3C6H5O7), som hadde størst forskjell i antall litiumioner per molekyl, ved fem forskjellige konsentrasjoner i et område på 1 mM-25 mM. Alle konsentrasjoner av litiumsitrat viste signifikant høyere akaricid aktivitet sammenlignet Med LiCl, men det var ingen forskjell i bienes dødelighet (Tabell 3, Supplerende Tabeller S9 og S11). Derfor kan litiumsitrat representere en enda bedre aktiv ingrediens.

Tabell 3 Sammenligning av effekt og bivirkninger Av LiCl og litiumsitrat ved bruk av konsentrasjoner fra 1 mM til 25 mM over en maksimal mateperiode på syv dager.

som en litiumfri kontroll og for å utelukke klorid som et aktivt middel testet vi også alkaliske salter natriumklorid (NaCl) og kaliumklorid (kcl) og også magnesiumklorid (MgCl) ved 25 mM. Vi observerte ikke en varroacid effekt for NaCl eller KCl (n = 3 bur, P = 1.000, log-rank test, Supplerende Tabell s12). I tester med MgCl døde 100% av de burede biene innen fem dager (P < 0.001, log-rank test), og i henhold til det fallende antall bier, ble forsøket avsluttet før effekten på kvaler kunne analyseres. Basert på disse forsøkene konkluderte vi med at litium faktisk medierer akaricid aktivitet på en doseavhengig måte, og at litiumcitrat utviser de gunstigste egenskapene til alle forbindelser som hittil er testet.

Potensial for litiumforbindelser som nytt varroacid

Vi har vist at ikke de opprinnelig hypoteserte dobbeltstrengede Rna mot essensielle varroa-gener, men overraskende litiumsalter formidler en sterk akaricid effekt på Varroa-myter på burbier og i kunstige sværmer. Dermed viser disse resultatene at litiumforbindelser representerer en ny klasse av akaricide midler med et fremragende potensial og bemerkelsesverdig god toleranse av bier. Den forskjellige følsomheten av kvaler og bier Til LiCl er enda mer bemerkelsesverdig med tanke på at Konsentrasjonen Av LiCl i biernes hemolymph på grunn av fortynningseffekter vil trolig være vesentlig lavere enn konsentrasjonen som tilføres biene.Det Er Viktig at våre funn ikke innebærer at akaricide effekter Av RNAi-baserte tilnærminger som publisert av Garbian et al.32 er vanligvis formidlet Av LiCl. Etter å ha matet en blanding av dsRNA til honningbier over en periode på 60 dager, garbian et al.32 registrerte en langsom økning i midd dødelighet med en endelig behandlingseffekt på bare 60%. I lys av den raske og svært effektive responsen til våre kunstige svermer på Behandlinger Med LiCl, er forskjellige virkningsmåter sannsynlig: Mens RNAi-medierte effekter ser ut til å utøve langsiktige effekter, representerer litiumforbindelser en uavhengig mekanisme med rask oppstart og høy effekt.

Som varroacid viser LiCl noen funksjoner som er unike i denne kombinasjonen: (I) LiCl virker systematisk via honningbi-mating («lett å bruke»), (ii) det er vannløselig og vil derfor ikke akkumuleres i bivoks,noe som er et avgjørende problem for langsiktige behandlingskonsepter ved bruk av syntetiske varroacider med lipofile egenskaper36, 37 (iii) den orale toksisiteten til de fleste litiumforbindelser til pattedyr er relativt lav38 (iv) det har ingen avstøtende effekt på mateoppløsningen innenfor det relevante konsentrasjonsområdet 2-25 mM39 og (v) den er tilgjengelig til moderate priser. Svært lovende er det faktum at en enkelt applikasjon av Bare 10 µ LiCl i en 25 mM oppløsning (tilsvarende en dose på 10,6 µ LiCl) per enkelt bie er tilstrekkelig til å drepe phoretic midd. En utfordring for videre forskning vil være utviklingen av en smart applikasjonsteknikk for sværmer og kolonier i full størrelse for å sikre at alle bier mottar den kritiske mengden av den aktive forbindelsen.

Foreløpig vet Vi Ikke Hvordan LiCl dreper phoretic Varroa midd, og det er få publikasjoner om effekten Av LiCl i insects40. I humanmedisin har litium blitt brukt siden 1870 – tallet og er et stemningsstabiliserende middel indisert for behandling av maniske episoder og som vedlikeholdsbehandling for bipolar lidelse41. I lys av deres terapeutiske bruk har litiumforbindelser og deres toksisitetsprofil blitt nøye undersøkt. Så langt har en rekke enzymer som virker på metabolisme, utvikling, hematopoiese og andre prosesser blitt foreslått som potensielle mål42,43. Disse enzymene krever metallioner og litium utøver sin aktivitet på en konkurransedyktig måte, som mest sannsynlig oppstår ved å forskyve en divalent kation. Ganske vist har vi for øyeblikket ingen indikasjon på at den observerte miticidale effekten av litiumforbindelser er avhengig av en sammenlignbar virkemåte.

vi er også klar over at våre resultater bare representerer det første skrittet mot utvikling av et nytt veterinærprodukt. Felttester i frittflygende kolonier er like nødvendige som analyse av sublethal og langsiktige bivirkninger på voksne bier og honningbi-brød og mulige restproblemer i honning.resultatene som presenteres her indikerer imidlertid allerede At LiCl har potensial som en effektiv og lett å bruke behandling for kunstige og naturlige sværmer og spesielt for det store antallet pakkebier som brukes til pollinering I Usa11, 44. Videre kan klargjøring av virkningsmekanismen åpne nye veier for målrettet utvikling av veterinærprodukter for å bekjempe Varroa-myter.