Tidlig tuberkulosebehandling med Xpert® MTB/RIF

Til Redaktørene:

Framskritt for å forbedre laboratoriekapasiteten for tuberkulose (TB) diagnose førte til utvikling av molekylære analyser som nå erstatter konvensjonell mikroskopi og kulturbaserte metoder i stor skala . Dessverre oppdager nåværende molekylære teknikker både levende og døde bakterier, og et positivt resultat innebærer ikke patogenes levedyktighet. FAKTISK KAN DNA vedvare i lang tid etter bakteriell død og nukleinsyre fra døde bakterier er like amplifiserbare. Molekylære analyser er derfor uegnet for behandlingsovervåking og / eller infeksjonskontroll.Vi rapporterer en innovativ tilnærming for selektivt å forsterke DNA avledet fra levedyktig Mycobacterium tuberculosis i kliniske prøver, noe som er nyttig for overvåking av mycobacterial belastning hos pulmonale TB-pasienter under anti-TB-behandling.protokollen er basert på forbehandling av prøver med propidiummonoazid (PMA; Biotium Inc., Hayward, CA, USA), en kjemisk forbindelse som kan interkalere DNA fra ikke-levedyktige (eller membranbeskadigede) organismer, men er utelukket fra levedyktige bakterier. ETTER lysaktivering binder PMA kovalent TIL DNA, og forhindrer forsterkningen av PCR . Etter lyseksponering er ubundet PMA ikke i stand til å interagere videre MED DNA-molekyler.analysen ble først optimalisert ved bruk av syrefaste baciller (AFB)-negative sputumprøver spikret med døde eller levende mykobakterier ved forskjellige konsentrasjoner. Kort sagt, levende Mycobacterium fortuitum celler ble tilsatt Til n-acetyl-cystein dekontaminert sputum prøver negative FOR AFB ved smøre mikroskopi ved en endelig konsentrasjon av 106 bakterier * mL-1. En aliquot av denne laboratorie-laget prøven ble behandlet for å varme drepe M. fortuitum celler. Pma-lagerløsningen ble utarbeidet og lagret ved -20°C og beskyttet mot lyseksponering, til bruk, som anbefalt av produsentene. PMA ble tilsatt som en forbehandling ved en endelig konsentrasjon på 500 µ og inkubert i 30 min ved 4°C i mørket, etterfulgt av lyseksponering for blå lysdiode (LED)-aktivt lys (GenIUL, Terrassa, Spania) i 15 min ved romtemperatur. DNA ble deretter ekstrahert ved hjelp av en standard fenolkloroformprosedyre. Som en kontroll for å evaluere effekten av lyseksponeringstrinnet, ble et aliquot av nakent DNA ekstrahert fra En m. fortuitum-kultur behandlet med 500 µ PMA som tidligere var utsatt FOR LED-lyset i 15 min. Commercial line-probe-analysen (GenoType® Mycobacterium CM; Hain Lifescience, Nehren, Tyskland) ble deretter utført for å identifisere klinisk relevante mykobakterielle arter . Prøver som inneholder levende M. fortuitum viste en normal hybridiseringsprofil på en nitrocellulosestrimmel, mens prøver behandlet for å drepe bakterier ikke viste noen forsterkning, bortsett fra den interne kontrollen (data ikke vist). Siden nakent DNA behandlet med lysinaktivert PMA viste en normal hybridiseringsprofil, var lyseksponeringstrinnet effektivt og PCR ble ikke ytterligere hemmet av gjenværende PMA.

etter å ha optimalisert protokollen for inaktivering AV DNA avledet fra døde bakterier, tilpasset vi den Til xpert® MTB/RIF automated assay (Cepheid, Sunnyvale, CA, USA). Sanntids PCR utført Av Xpert® MTB / RIF gir terskelsykluser (Ct) som kan brukes til å beregne forskjellen i amplifiseringsutbytte mellom prøver med og uten pma forbehandling (ΔCt): en lav Δ indikerer tilstedeværelse av amplifiserbart DNA fra levende bakterier, mens en høy Δ indikerer at mål-DNA i prøven stammer fra døde eller skadede bakterier, og DERFOR påvirker pma forbehandling signifikant forsterkningen. For å beregne Δ-verdien vurderte vi gjennomsnittet mellom Ct-verdiene som ble oppgitt for hver sonde inkludert I Xpert® MTB / RIF-testen (A Til E) .

Vi testet pma-protokollen ved Hjelp Av Xpert® MTB / RIF-analysen på En Ct-kalibreringskurve AV AFB-negative kliniske prøver med varmedødte/levende mykobakterier tilsatt i forskjellige forhold. Høye død-levende forhold resulterte i en maksimal forskjell I Δ verdier mellom varmebehandlede og levende deler MED PMA, mens prøver som inneholder en tilsvarende prosentandel av drepte og levende bakterier ikke kunne differensieres fra hverandre ved bruk AV pma forbehandling (data ikke vist). Lignende data har blitt rapportert Av Kralik et al. .

Til slutt testet vi tilnærmingen på kliniske prøver. 10 pasienter diagnostisert med aktiv LUNGETUBERKULOSE (sputumutstryk positiv og kulturpositiv) ble inkludert i den første valideringsstudien. Prøver ble samlet på diagnosetidspunktet (t0) og etter 10-20 dagers behandling (t1), n-acetyl-cystein dekontaminert og behandlet FOR mgit-960 væskekultur (Bd Diagnostic Systems, Sparks, MD, USA) i henhold til internasjonale retningslinjer . Alle pasientene var FORTSATT AFB-positive ved sputum smear mikroskopi ved t1. Parallelt ble 250 µ av dekontaminerte prøver behandlet for molekylær analyse ved Xpert® MTB/RIF-analyse med og uten pma forbehandling. Prøvene ble deretter behandlet som anbefalt av produsentens anvisninger For xpert® MTB/RIF-analysen.

SOM vist i figur 1 påvirket PMA ikke pcr-utbyttet signifikant av prøver samlet inn ved t0 (gjennomsnittlig±sem Δ 2.3±0.5), mens prøver samlet inn under behandling ved t1 viste En Δ På 10,5±0,9 etter PMA-behandling (p=0.0003) som bekrefter at sputumutsmykningspositiviteten til disse prøvene hovedsakelig skyldtes svært skadede bakterier. Videre ble Det funnet at Δ beregnet mellom t0 og t1 i PMA-ubehandlede prøver var for lave (Δ 2.9±0.9) til å sette pris på en reell reduksjon i bakteriebelastningen på grunn av behandlingen.

To pasienter vurdert » lav «ved t0 ved Xpert® viste en negativ kultur ved t1, mens alle de andre pasientene vurdert «medium» eller » høy » forble kulturpositive ved MGIT. Selv om en nøyaktig tid til positivitet ikke kan vurderes, observerte vi at kulturer fra prøver samlet ved t1 ble positive omtrent 7-10 dager senere sammenlignet med kulturer fra prøver samlet ved t0, noe som tyder på en alvorlig reduksjon i levende bakteriebelastning.

alle pasientene ble vellykket behandlet og kurert ved slutten av behandlingen, og dette var i samsvar med reduksjonen av levende bakterier oppdaget AV PMA-analysen.

som negativ kontroll inkluderte vi også en behandlingssvikttilfelle (AFB positiv og kultur positiv etter 5 måneders standardbehandling). I dette tilfellet påvirket IKKE PMA forbehandling av både dekontaminerte sputumprøver som ble samlet inn ved 1 måned og to under behandling SIGNIFIKANT PCR-utbyttet (ΔCt ∼2), og støttet dermed ineffektiviteten av ANTI-TB-behandling.den samme protokollen bør i prinsippet være kompatibel med ANDRE CE-godkjente molekylære tester og linjeprobeanalyser godkjent Av Verdens Helseorganisasjon for DIAGNOSE AV TB; videre studier er nødvendig for å utelukke denne muligheten.

Tidligere studier har vist muligheten FOR Å bruke PMA til å skille mellom levende og døde mykobakterier ved bruk av en konsentrasjon på 25-50 µ. Under protokoll satt opp, ble en endelig konsentrasjon på 100 µ fullstendig unngått forsterkning av DNA avledet fra varmedødte m. fortuitum; en svak bakgrunn på grunn av forsterkning AV DNA fra varmedødte m. tuberkulose ble observert (data ikke vist). Vi kan spekulere på at den forskjellige celleveggsammensetningen på en eller annen måte påvirker pmas evne til å trenge inn i skadede mykobakterier. Faktisk, Kralik et al. observert AT PMA-indusert signalreduksjon mellom levende Og døde Mycobacterium avium subsp. paratuberkulose var lavere sammenlignet med de som ble funnet for andre bakteriearter. I tillegg, med tanke på mengden rusk som potensielt kunne beslaglegge PMA-molekyler i dekontaminert sputa, økte vi den endelige konsentrasjonen til 500 µ. Videre studier som evaluerer forskjeller I PMA – behandlingseffekt på stammer som viser forskjellig celleveggsammensetning (F. eks. Beijing-stammer) og / eller i sputa med forskjellige egenskaper (f. eks. blodholdig sputum) kan bedre belyse nytten av denne testen i ulike kliniske innstillinger.

I Henhold Til Lø et al. , en liten andel av celler som antas å være døde eller tungt skadet, kan ikke vokse. Tilstedeværelsen av et lite antall celler som er tungt skadet, men ikke-dyrkbare, kan forklare hvorfor vi fortsatt har et positivt signal i prøver samlet på t1 til tross FOR pma-forbehandlingen. Pma forbehandling unngår ikke påvisning av en liten andel døde celler (falsk positiv for en levedyktighetsanalyse): testen kan derfor overvurdere levedyktige mykobakterier. Fra et klinisk perspektiv vil dette imidlertid utgjøre en mindre feil sammenlignet med risikoen (svært liten for denne testen) for å undervurdere levedyktige mykobakterier.Våre data indikerer for første gang at kvantitative molekylære teknikker kombinert MED pma-metoden kan være et alternativ til direkte mikroskopi og kultur for overvåking av tidlig behandlingsrespons og for foreløpig evaluering av personlige regimer. Bruken av denne analysen kan tillate tidligere evaluering av behandlingseffekt, og viser en klar reduksjon i vital mykobakteriell belastning. Fraværet av respons på terapi kan imidlertid også raskt identifiseres ved testen som tillater en regimeendring og begrenser spredning av infeksjon og videre resistensutvikling .

• 2 ERS 2012