chlorek litu skutecznie zabija pasożyta pszczoły miodnej Varroa destructor poprzez systemowy sposób działania
badanie pilotażowe: od RNAi do chlorku litu
w badaniu pilotażowym porażone roztoczami pszczoły miodne były trzymane w klatkach i karmione syropem sacharozowym zawierającym dsRNA potencjalnie istotnych genów Varroa (tabela uzupełniająca S1). Zwykły syrop sacharozowy (nieprzetworzony)i syrop z dsRNA oparty na sekwencji kodującej zielone fluorescencyjne białko GFP (dsgfp ctrl) służyły jako kontrolki. GFP wyraża się w bioluminescencyjnej hydrozoańskiej Meduzie Aequorea victoria. Sekwencja GFP została wybrana jako kontrolna, ponieważ w genomie pszczół miodnych lub roztocza Varroa nie istnieje homologiczny Gen. W nieleczonej grupie śmiertelność roztoczy wynosiła<5%. Natomiast wszystkie roztocza pszczół, które otrzymały roztwór sacharozy zawierający dsRNA ukierunkowany na geny Varroa, zostały skutecznie zabite w ciągu trzech dni. Jednak identyczny wpływ na roztocza zaobserwowano w eksperymencie kontrolnym, w którym pszczoły były karmione GFP dsRNA (Fig. S1). Wyniki te wykluczyły proponowany mechanizm pośredniczący w RNAi, ale sugerowały albo Nieznany jeszcze efekt RNA, albo aktywność innych składników w badanym roztworze. Ponieważ do produkcji dsRNA stosowano wysokie stężenia chlorku litu (LiCl) i dlatego podawano je pszczołom razem z dsRNA, zdecydowaliśmy się na podawanie LiCl w roztworze sacharozy pszczołom w klatkach, aby przetestować jego aktywność przeciwko roztoczom Varroa. Co uderzające, LiCl w stężeniach 25 mM, co odpowiada obliczonemu stężeniu w roztworze dsRNA, zabijał roztocza tak skutecznie, jak substancje testowe zawierające dsRNA. Ponadto, po usunięciu LiCl z dsRNA przez intensywne przemywanie (washed dsgfp ctrl), aktywność mitycydowa została znacznie zmniejszona, na co wskazuje opóźniony początek i zmniejszona aktywność(Fig. S1). Na podstawie tych danych doszliśmy do wniosku, że LiCl, a nie knockdown RNA, pośredniczy w obserwowanej aktywności roztoczy Varroa i że warto byłoby przeanalizować potencjał LiCl jako warroacydu.
skuteczne stężenie chlorku litu
aby potwierdzić podstawowe obserwacje naszego badania pilotażowego, ustanowiliśmy eksperymenty klatkowe z różnymi stężeniami LiCl w celu solidnej analizy statystycznej. Oprócz stężenia 25 mM, które okazało się skuteczne w badaniu pilotażowym, wykorzystaliśmy stężenia 2 mM, 4 mM i 10 mM w celu określenia niższego progu skuteczności. Wyniki potwierdziły wyniki poprzedniego badania i wykazały znaczący wpływ na mitycidal w stężeniach LiCl tak niskich, jak 2 mM, przy których wykazano znaczny wzrost śmiertelności roztoczy (P < 0,001, test log-rank; tabela uzupełniająca S2). Wyższe stężenia 10 mM i 25 mM znacznie zwiększyły śmiertelność roztoczy począwszy od drugiego dnia leczenia i osiągnęły eksterminację ponad 96% leczonych roztoczy na koniec eksperymentu (rys. 1a, tabela uzupełniająca S2). W doświadczeniach kontrolnych bez LiCl w roztworze żywieniowym śmiertelność roztoczy osiągnęła średnio 9,3%, a zatem mieściła się w zakresie wskaźników śmiertelności uzyskanych dla roztoczy trzymanych na nieleczonych pszczołach klatkowych w różnych warunkach środowiskowych33. Na podstawie tych wyników potwierdziliśmy wyraźny wpływ LiCl na żywotność roztoczy w zakresie stężeń od 2 mM do 25 mM.
śmiertelność for roztocza Varroa i pszczoły miodne po karmieniu pszczołami w klatkach chlorkiem litu (LiCl). a) krzywa przeżycia samic roztoczy Varroa trzymanych w klatkach karmionych LiCl w stężeniach od 2 mM do 25 mM (N = 33, 9, 9, 12 i 9 klatek odpowiednio dla 0 mM (kontrola), 2 mM, 4 mM, 10 mM i 25 mM). Przy wszystkich stężeniach przeżywalność roztoczy w badanych grupach była znacząco różna od grupy kontrolnej (P < 0,001, test log-rank z korekcją Bonferroni). B) krzywa przeżycia pszczół robotnic w klatkach i samic roztoczy Varroa po 24 h ekspozycji na LiCl (N = 9 klatek). Przeżywalność roztoczy w grupie leczonej była znacząco różna od grupy kontrolnej (P < 0,001, test log-rank), ale nie stwierdzono istotnych różnic w śmiertelności pszczół.
w tych eksperymentach pszczoły w klatkach były karmione odpowiednim stężeniem LiCl przez kilka dni, aż wszystkie roztocza zostały zabite w wyniku leczenia. Jednak w przypadku potencjalnego zastosowania w praktyce pszczelarskiej preferowany byłby krótszy i zdefiniowany okres leczenia. Dlatego przeprowadziliśmy dodatkowe doświadczenie, w którym najskuteczniejsze stężenie LiCl 25 mM (rys. 1a) podawano przez 24 godziny, a następnie karmiono roztworem cukru przez kolejne 6 dni. Pod koniec okresu obserwacji, 92.9% roztoczy (N=225 roztoczy, P < 0,001, test log-rank) zabito bez istotnego wpływu na leczone pszczoły (patrz następny akapit). Wynik ten wyraźnie pokazuje, że nawet krótkotrwałe karmienie 25 mM LiCl jest wystarczające do znacznego zmniejszenia populacji roztoczy.
aby precyzyjnie określić ilość LiCl spożywaną przez pszczoły, która jest niezbędna do zabicia pasożytujących roztoczy, 12 nowo wyklutych pszczół sztucznie karmiono 10 µl roztworów LiCl o grubości od 4 mM do 100 mM i trzymano pojedynczo z roztoczem phoretic przez pięć dni w klatkach. W przypadku roztworów 4 mM i 10 mM, które odpowiadały pobieraniu odpowiednio 1,7 µg i 4,2 µg LiCl, efekt nie różnił się znacząco od nieleczonej grupy kontrolnej (N = 12 roztoczy, P = 1,000, test log-rank, tabela uzupełniająca S3). Jednak pojedyncza dawka 25 mM, odpowiadająca 10,6 µg LiCl spożywanego przez pszczołę, była wystarczająca do zabicia 100% roztoczy for w ciągu 48 godzin (rys. 2).
śmiertelność roztoczy Varroa phoretic trzymanych na pszczołach, które były karmione pojedynczo 10 µl roztworu chlorku litu w stężeniach od 4 mM do 4 mm. 100 mm. pszczoły były karmione LiCl tylko raz na początku eksperymentu, a następnie otrzymywały syrop sacharozowy przez pięć dni. Dla każdego stężenia przeanalizowano 12 klatek z jedną pszczołą i jednym roztoczem Varroa. Przeżywalność roztoczy była znacznie zmniejszona w porównaniu z grupą kontrolną, gdy pszczołom podawano stężenia 25 mM i wyższe (p < 0,001, test log-rank).
wpływ na pszczoły robotnice
do analizy tolerancji LiCl na pszczoły robotnice wykorzystano klatki testowe do analizy śmiertelności roztoczy (rys. 1a) były dodatkowo rejestrowane pod kątem śmiertelności pszczół robotnic. Po ekspozycji na LiCl o grubości 2 mM, 10 mM i 25 mM, które wykazywały aktywność mitobójczą, śmiertelność leczonych pszczół pracowniczych wahała się średnio od 3 do 7% w różnych grupach żywienia. Z wyjątkiem grupy LiCl 10 mM (N = 12 klatek, P = 0,015, test log-rank; tabela uzupełniająca S4), wartości nie różniły się znacząco od 4% śmiertelności w nieleczonej grupie kontrolnej. Ponadto wskaźniki śmiertelności naszych kontroli mieściły się w zakresie śmiertelności nieleczonych pszczół klatkowych wymaganym jako kontrola w testach toksykologicznych34, co potwierdza ważność naszego systemu badań. Również 24-godzinne leczenie LiCl nie miało wpływu na śmiertelność pszczół robotnic (rys. 1b; n = 9 klatek, P = 0,308, test log-rank). Dobrą tolerancję LiCl dla pszczół potwierdzono również przez karmienie pojedynczą dawką (dla śmiertelności roztoczy patrz Fig. 2), które nie powodowały znacznego wzrostu śmiertelności pszczół pracujących (P = 1.000, test log-rank; tabela uzupełniająca S5).
następnie różne stężenia LiCl były karmione w sposób ciągły aż do śmierci ostatniej pszczoły w klatkach w celu zbadania odpowiedzi na długotrwałe narażenie. W tym przypadku leczenie znacznie zmniejszyło średnią długość życia świeżo wyklutych pszczół robotnic z 26 dni w nieleczonych klatkach kontrolnych do 23 i 22 dni odpowiednio dla 2 mM i 10 mM LiCl (N = 60 pszczół, P = 0,024, test log-rank; tabela uzupełniająca S6). U pszczół, które otrzymały najwyższe stężenie LiCl 25 mM, długość życia została znacznie skrócona do średnio 19 dni (Fig. 3A).
śmiertelność pszczół miodnych po karmieniu ich klatkami chlorkiem litu. a) krzywa przeżycia pszczół robotnic w klatkach podczas chronicznej ekspozycji na LiCl. Diety LiCl w stężeniach 2 mM, 10 mM i 25 mM były karmione ad libitum aż do śmierci ostatniej pszczoły (n = 6 klatek po 10 pszczół). Przeżywalność wszystkich leczonych grup była znacząco różna od kontroli syropu cukrowego (P < 0,01, test log-rank z korekcją Bonferroni). B) krzywa przeżycia pszczół robotnic w klatkach po ekspozycji na LiCl w ciągu 24 godzin. Diety LiCl w stężeniach 2 mM, 10 mM i 25 mM były karmione ad libitum przez pierwsze 24 godziny po wykluciu, a następnie zastępowane syropem sacharozowym (n = 12 klatek po 10 pszczół). Przeżycie wszystkich leczonych grup nie różniło się znacząco od kontroli syropu cukrowego (P > 0,1, test log-rank z korekcją Bonferroni).
jednak LiCl wydaje się ograniczać żywotność pszczół tylko wtedy, gdy jest podawany przez dłuższy okres czasu, na co wskazuje dodatkowe doświadczenie, w którym LiCl był karmiony przez pierwsze 24 godziny po wykluciu, a następnie był zastępowany syropem sacharozowym aż do śmierci ostatniej pszczoły w klatce (rys. 3b). Średnia długość życia świeżo wyklutych pszczół robotnic wynosiła w tym przypadku od 22 dni (10 mM) do 24 dni (Kontrola) Bez istotnych różnic pomiędzy zabiegami (N = 120 pszczół na zabieg, P ≥ 0,126, test log-rank; tabela uzupełniająca S7). Na podstawie tych danych pochodzących od pszczół w klatkach wnioskujemy, że nawet krótkotrwałe leczenie LiCl jest wystarczające do całkowitego wyeliminowania inwazji roztoczy Varroa z niewielkim lub żadnym wpływem na żywotność pszczół robotnic. Wyniki uzyskane w testach klatkowych w kontrolowanych warunkach stanowią udany i obiecujący pierwszy krok w kierunku nowego podejścia do leczenia Varroa. Jednak skuteczność i skutki uboczne muszą być potwierdzone w warunkach polowych.
testy polowe z chlorkiem litu w sztucznych Rojach
aby uzyskać przybliżone warunki polowe, przetestowaliśmy LiCl 25 mM i 50 mM w dziewięciu sztucznych Rojach bez potomstwa składających się z królowej i około 20 000 pszczół. Stężenia te zostały wybrane na podstawie wcześniejszych doświadczeń z pszczołami w klatkach przy użyciu najwyższej dawki, która była nadal tolerowana przez pszczoły w krótkim czasie aplikacji (25 mM). Ponieważ równomierne rozprowadzenie syropu sacharozowego w całym sztucznym roju około 20 000 pszczół mogło być trudne do osiągnięcia, dodatkowo przetestowaliśmy stężenie LiCl o stężeniu 50 mM, aby upewnić się, że każda pszczoła była narażona na wystarczające ilości litu. W związku z tym roje były karmione ad libitum syropem sacharozowym zawierającym 25 mM LiCl (N = 6) lub 50 mM (n = 3) przez okres trzech dni, po czym stosowano miejscowo Perizin®. Perizin® zawierający kumafosforan organofosforanu jako składnik aktywny jest wysoce skutecznym warroacydem, powszechnie stosowanym w leczeniu kontrolnym35. Śmiertelność roztoczy była monitorowana przez okres pięciu dni. Przed leczeniem kontrolnym 25 mM LiCl zabiło około 90% roztoczy obecnych w sztucznych Rojach(Tabela 1). Wyższy stężony roztwór (50 mM) nie zwiększył jednak tego efektu (χ2 test, P = 0,953). Ogólnie skuteczność była nieco niższa w porównaniu z testami klatkowymi. Jednym z wyjaśnień może być to, że dystrybucja LiCl w klastrze tysięcy pszczół wymaga więcej czasu, dopóki ostatnia pojedyncza pszczoła nie spożyje wystarczającej dawki, aby zabić odpowiednie pasożytujące roztocza. Niezbędny czas karmienia tak ogromnych Bytów liczących ponad 20 000 pszczół musi być analizowany w dalszych eksperymentach.
skuteczność innych związków litu i soli nielitowych
aby potwierdzić działanie litu na roztocza Varroa, przetestowaliśmy szereg związków litu i porównaliśmy działanie mitycydowe z solami nielitowymi. Szczególnie interesujący był cytrynian litu, związek z trzema jonami litu, siarczanem litu i węglanem litu, które mają dwa jony litu w porównaniu do tylko jednego jonu litu w LiCl. W celu analizy skuteczności i tolerancji w porównaniu z LiCl uwzględniono dodatkowe związki z jednym jonami litu (mleczan litu, octan litu), ale różną rozpuszczalnością, reaktywnością chemiczną i ceną. W eksperymentach z klatkami wszystkie związki eliminowały 100% roztoczy przy 25 mM w ciągu trzech (cytrynian litu i octan litu) do czterech dni (siarczan litu, mleczan litu i węglan litu). Ponadto 4-mM roztwory testowe całkowicie zabiły roztocza w ciągu pięciu (cytrynian litu, siarczan litu i octan litu) do siedmiu dni (mleczan litu), z wyjątkiem węglanu litu (Tabela 2; Tabela uzupełniająca S8).
śmiertelność pszczół pracowniczych nie była znacząco zwiększona przy żadnym stężeniu w porównaniu z nieleczonymi pszczołami kontrolnymi, z wyjątkiem 25 mM siarczanu litu i 25 mM mleczanu litu (tabela uzupełniająca S9). Dzięki tym eksperymentom możemy potwierdzić, że inne związki litu mają podobny potencjał zastosowania jako ogólnoustrojowy akarycyd. Może to zwiększyć elastyczność możliwego projektowania produktu weterynaryjnego. Biorąc pod uwagę cenę, chlorek litu i cytrynian litu są najtańszymi związkami. Siarczan litu jest mniej odpowiedni ze względu na niższą tolerancję pszczół i węglan litu ze względu na stosunkowo niską rozpuszczalność w wodzie.
aby dokładniej zbadać skuteczność związków litu zależną od stężenia, porównaliśmy LiCl z cytrynianem litu (Li3C6H5O7), który miał największą różnicę w liczbie jonów litu na cząsteczkę, przy pięciu różnych stężeniach w zakresie 1 mM-25 mM. Wszystkie stężenia cytrynianu litu wykazywały znamiennie wyższą aktywność roztoczobójczą w porównaniu z LiCl, ale nie było różnicy w śmiertelności pszczół (Tabela 3, tabele uzupełniające S9 i S11). Dlatego cytrynian litu może stanowić jeszcze lepszy składnik aktywny.
jako kontrolka bez litu i aby wykluczyć chlorek jako czynnik aktywny, przetestowaliśmy również sole alkaliczne chlorek sodu (NaCl) i chlorek potasu (KCl), a także chlorek magnezu (MgCl) przy 25 mM. nie zaobserwowaliśmy efektu varroacidal dla NaCl lub KCl (N = 3 klatki, P = 1.000, test log-rank, tabela uzupełniająca S12 ). W testach z MgCl 100% pszczół w klatkach zmarło w ciągu pięciu dni (P < 0.001, test log-rank), a w zależności od zmniejszającej się liczby pszczół, eksperyment został zakończony, zanim można było przeanalizować wpływ na roztocza. Na podstawie tych doświadczeń doszliśmy do wniosku, że lit rzeczywiście pośredniczy w działaniu roztoczobójczym w sposób zależny od dawki, a cytrynian litu wykazuje najkorzystniejsze właściwości spośród wszystkich dotychczas badanych związków.
potencjał związków litu jako nowego warroacydu
wykazaliśmy, że nie początkowo hipotezy dwuniciowe RNA przeciwko podstawowym Genom Varroa, ale zaskakująco sole litu pośredniczą w silnym działaniu roztoczów Varroa na pszczoły w klatkach i w sztucznych Rojach. Wyniki te pokazują, że związki litu reprezentują nową klasę środków roztoczobójczych o wyjątkowym potencjale i wyjątkowo dobrej tolerancji przez pszczoły. Różna podatność roztoczy i pszczół na LiCl jest jeszcze bardziej niezwykła, biorąc pod uwagę, że ze względu na efekty rozcieńczania stężenie LiCl w hemolimfie pszczół będzie prawdopodobnie znacznie niższe niż stężenie karmione pszczołami.
Co Ważne, nasze wyniki nie sugerują, że roztoczobójcze działanie podejść opartych na RNAi, opublikowane przez Garbian et al.32 są zazwyczaj pośredniczone przez LiCl. Po karmieniu mieszaniną dsRNA pszczołom miodnym przez okres 60 dni, Garbian et al.W badaniu 32 odnotowano powolny wzrost śmiertelności na roztocza, a skuteczność końcowego leczenia wynosiła zaledwie 60%. Ze względu na szybką i wysoce skuteczną reakcję naszych sztucznych rojów na leczenie LiCl, prawdopodobne są różne tryby działania: podczas gdy efekty pośredniczone przez RNAi wydają się wywierać długotrwałe efekty, związki litu stanowią niezależny mechanizm o szybkim początku i wysokiej skuteczności.
jako varroacide, LiCl wyświetla pewne cechy, które są unikalne w tej kombinacji: (i) LiCl działa systemowo poprzez karmienie pszczół miodnych („łatwy do zastosowania”), (ii) jest rozpuszczalny w wodzie i w związku z tym nie gromadzi się w wosku pszczelym,co stanowi kluczowy problem dla długoterminowych koncepcji leczenia z użyciem syntetycznych warroacydów o właściwościach lipofilowych36, 37 (iii) toksyczność doustna większości związków litu dla ssaków jest stosunkowo niska38 (iv) nie ma odstraszającego wpływu na roztwór do karmienia w odpowiednim zakresie stężeń 2-25 mM39 oraz (v) jest dostępny po umiarkowanych cenach. Wysoce obiecujący jest fakt, że pojedyncza aplikacja tylko 10 µl LiCl w 25 mM roztworze (odpowiadająca dawce 10,6 µg LiCl) na pojedynczą pszczołę jest wystarczająca do zabicia roztoczy phoretic. Wyzwaniem dla dalszych badań będzie opracowanie inteligentnej techniki aplikacji pełnowymiarowych rojów i kolonii, aby zapewnić, że wszystkie pszczoły otrzymają krytyczną ilość aktywnego związku.
obecnie nie wiemy, w jaki sposób LiCl zabija phoretic Varroa mites, i istnieje niewiele publikacji na temat wpływu LiCl w owadach40. W medycynie ludzkiej lit jest stosowany od 1870 roku i jest środkiem stabilizującym nastrój wskazanym do leczenia epizodów maniakalnych i jako leczenie podtrzymujące zaburzenia afektywne dwubiegunowe41. Ze względu na ich zastosowanie terapeutyczne, związki litu i ich profil toksyczności zostały dokładnie zbadane. Do tej pory jako potencjalne cele zaproponowano szereg enzymów wpływających na metabolizm, rozwój, hematopoezę i inne procesy42,43. Enzymy te wymagają jonów metali, a lit wywiera swoją aktywność w niekonkurencyjny sposób, co najprawdopodobniej następuje poprzez wyparcie kationu dwuwartościowego. Co prawda, obecnie nie mamy żadnych wskazówek, że obserwowane działanie mitycydowe związków litu opiera się na porównywalnym sposobie działania.
zdajemy sobie również sprawę z tego, że nasze wyniki stanowią tylko pierwszy krok w kierunku opracowania nowego produktu weterynaryjnego. Badania terenowe w koloniach wolno latających są tak samo niezbędne, jak analiza subletalnych i długoterminowych skutków ubocznych dla dorosłych pszczół i miodu pszczelego oraz możliwych problemów z pozostałościami w miodzie.
jednak już przedstawione wyniki wskazują, że LiCl ma potencjał jako skuteczny i łatwy do zastosowania sposób leczenia sztucznych i naturalnych rojów,a w szczególności ogromnej liczby pszczół paczkowanych wykorzystywanych do zapylania w Stanach Zjednoczonych11, 44. Ponadto wyjaśnienie mechanizmu działania może otworzyć nowe możliwości ukierunkowanego rozwoju produktów weterynaryjnych do zwalczania roztoczy Varroa.